基因实验论文.doc

内蒙古大学生命科学学院生物系本科生基因工程实验论文分类号: Q78 编号: 本科生基因工程实验论文碱性磷酸酶基因表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达指导教师： 王郑 苏慧敏 学 生： 刘 帆 专 业： 生物科学 年 级： 2010级 2013 年 9 月 1 日碱性磷酸酶基因表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达（刘帆 01011017 生物科学）摘要：碱性磷酸酶广泛分布于人体各脏器器官中，这种酶能催化核酸分子脱掉5磷酸基团，从而使DNA或RNA片段的5-P末端转换成5-OH末端。碱性磷酸酶在酶联免疫等生化检测中有重要作用，是许多生化反应试剂盒的检测酶。从大肠杆菌提取的碱性磷酸酶成本低，热稳定性好，而且能用基因方法实现蛋白质定向标记等。本文主要介绍利用基因工程实验技术操作碱性磷酸激酶基因，将已经连接在pMD19-T载体上的碱性磷酸激酶酶源基因用PCR扩增出837bp的碱性磷酸激酶的基因片段，与T载体连接后导入感受态的DH5菌中筛选鉴定。用双酶切切下碱性磷酸激酶的成熟基因片段，插入带有6个组氨酸标签的原核表达载体pET-his，导入 BL(21)DE3感受态菌中诱导表达碱性磷酸激酶蛋白质，用SDS-PAGE鉴定。关键词：碱性磷酸酶 基因表达 载体 大肠杆菌 SDS-PAGEConstruction and Expression of Alkaline Phosphatase Expression Vector in E.coli ABSTRACT：Alkaline phosphatase is a widely distributed in human organs in various organs , the enzyme catalyzes the nucleic acid molecule off the 5 phosphate group , so that the DNA or RNA fragments of the 5-P terminal converts 5-OH ends . Alkaline phosphatase in ELISA and other biochemical detection plays an important role in many biochemical reactions kit detection enzymes. Extracted from E. coli alkaline phosphatase , low cost, good thermal stability, but also can be used genetic methods to achieve protein orientation markings.Main of this article describe the gene engineering operation in BAP gene which has already connected with pMD-1-T vector amplified by PCR in which can get 837bp nattokinase gene fragments ,then liBAPing with T vector that transform it into DH5 bacteria which were screened after identification. The mature peptide can be cutted by double-digested and insert with six histidine-tagged prokaryotic expression vector pET-his. At last, induced the protein expression of nattokinase in the expression of E.coli BL (21) DE3. Eventually , identify that by SDS-PAGE.KEYWORDS: Bacterial alkaline phosphatase , gene expression, vector，E. coli, SDS-PAGE目 录引言1材料与方法1材料1.1试剂、仪器及实验用具1.2菌种1.3质粒1.4常用溶液的配制2方法2.1引物的设计2.2 碱性磷酸激酶基因的PCR扩增2.3 DH5a和BL21感受态的制备2.4 pMD19-T-BAP的构建及转化和检测2.5 pET-his及BAP的酶切和回收2.6 pET-his-BAP的构建及转化和检测2.7 pET-his-BAP的诱导表达2.8 细菌碱性磷酸酶表达的SDS-PAGE检测3结果与分析3.1 碱性磷酸激酶基因的PCR扩增3.2 pET-his的提取，酶切及胶回收检验3.3 pMD19-T-BAP的构建转化检测3.4 pMD19-T-BAP的酶切3.5 pMD19-T-BAP胶回收的结果3.6 pET-his-BAP的构建及转化和检测3.7 SDS-PAGE检测pET-his-BAP的表达4讨论参考文献致谢感想引言:碱性磷酸酶广泛分布于人体各脏器器官中，其中以肝脏为最多其次为肾脏，骨骼、肠、和胎盘等组织，。这种酶能催化核酸分子脱掉5磷酸基团，从而使DNA或RNA片段的5-P末端转换成5-OH末端。但它不是单一的酶，而是一组同功酶。目前已发现有 AKP1 、AKP2 、AKP3 、AKP4 、AKP5 与 AKP6 六种同功酶。细菌碱性磷酸酶是分子生物学的重要工具酶。在碱性条件下，可以催化磷酸单脂水解，生成无机磷酸。在ELISA过程中，BAP常用作标记二抗的酶显色。近年来，国内外一些学者直接将BAP与抗体蛋白融合表达，避免了酶标二抗的使用和交叉反应，不仅在疾病诊断中有显著优势，还可以检测与之融合的各种单链抗体的活性。碱性磷酸酶在酶联免疫等生化检测中有重要作用，是许多生化反应试剂盒的检测酶。目前国内市场引用的碱性磷酸酶都是从国外进口，并且是有牛、猪肝脏提取，价格昂贵且产量不高。从大肠杆菌提取的碱性磷酸酶成本低，热稳定性好，而且能用基因方法实现蛋白质定向标记等。材料与方法1.材料1.1试剂、仪器及实验用具1.1.1仪器台式离心机，旋涡混合器，微量移液取样器，气浴振荡摇床，制冰机，超净工作台，微波炉和电磁炉，电泳仪和电泳槽，电子分析天平，恒温水浴锅，紫外分光光度计，PCR仪，三用紫外分析仪，恒温细菌培养箱，凝胶成像仪，高压蒸汽灭菌锅。1.1.2实验用具超净工作台，玻璃涂布棒，酒精灯，双面微量离心管架，试管架，记号笔,手表，摇菌试管，1.5mL离心管，0.5mL微量离心管，枪头（010uL，20200uL，2001000uL），100mL三角瓶，250mL 三角瓶，凝胶成像系统，一次性薄膜手套等,0.2mLPCR微量管，泡沫塑料保温盒，培养皿，琼脂糖凝胶电泳槽和梳子及其制胶模块, 垂直电泳槽及配套的玻璃板、夹子、密封条、梳子。 1.1.3试剂LB 培养基， 氨苄青霉素储存液， 无菌ddwater， 200mg/mL（M/V）IPTG， 20%葡萄糖，1.0mol/L Tris HCl （pH8.8）， 0.5mol/L Tris HCl（ pH6.8），10%SDS，30% Acr/Bis， 10% Aps，2上样缓冲液，TEMED ，低分子量蛋白分子量 Marker，考马斯亮蓝染色液， 5 X电泳缓冲液，20%（M/V）IPTG，2%（M/V）X-gal，50 X TAE电泳缓冲液，溴化乙锭储存液，10加样缓冲液，6加样缓冲液，DNA分子量Marker，电泳级琼脂糖粉，Premix Taq， 10mg/mL RNase A，TE缓冲液，95%和 70%乙醇，EcoR I 和 BamH I 限制性内切酶，10内切酶缓冲液，0.1 mol/L CaCl2溶液，T4 DNA连接酶，连接酶缓冲液。1.2菌种带有 pET-his 质粒载体DH5菌,带有pMD19-T-BAP载体的DH5菌， E.coli DH5，E.coli BL21（由基因工程实验室提供）。1.3 质粒表达载体：pET-his1.4 常用溶液的配制1.4.1 氨苄青霉素储存液：无菌水配制 100mg/mL，分装后-20C保存。1.4.2 LB 培养基：胰化蛋白胨 10g，酵母提取物 5g，NaCl 10g，加 200mL ddwater 搅拌完全溶解，用约NaOH 调 pH 至 7.0，加 dd water 至 1L，分装4个200ml和2个100ml,121 20min 灭菌。使用时可加入氨苄青霉素，终浓度100ug/mL。1.4.3 溶液（NaOH/SDS溶液）：0.2mol/L NaOH，1%SDS,现用现配。1.4.4 50TAE电泳缓冲液（pH约8.5）：Tris碱242g,57.1ml冰乙酸，37.2g Na2EDTA2H2O，dd water 定容至1L。使用时稀释成1。1.4.5 琼脂糖凝胶：称取0.25g琼脂糖粉，放入三角瓶，加入25ml 1TAE 电泳 缓冲液（注意原液是50，按照1:49的比例稀释），用保鲜膜盖住，放入微波炉里烧开（30 s），取出观察，若无颗粒则置于桌面上冷却至不烫手即可灌胶，若仍然有颗 粒状物，需要再继续加热，直至无颗粒后冷却灌胶。1.4.6 1.0mol/L Tris HCl pH8.8：称取12.1g Tris碱, 加50mL蒸馏水，缓慢地加浓盐酸至pH8.8（约加 8mL）。让溶液冷却至室温，pH将会升高，然后再调至 pH8.8，加蒸馏水至 100mL。高温高压灭菌后 4保存。1.4.7 0.5mol/L Tris HCl pH6.8：称取 6.05g Tris 碱溶于 40mL 蒸馏水中，加约 48mL 1mol/L HCl，让溶液冷却至室温，再用 HCl 调至 pH6.8，加水稀释到 100mL 终体积。高温高压灭菌后 4保存。1.4.8 30% Acr（丙烯酰胺）/Bis（N,N-亚甲基双丙烯酰胺）：30g Acr+0.8g Bis，用 dd water定容至100mL，4C棕色瓶避光保存（现用现配）。1.4.9 10% Aps（过硫酸铵）：蒸馏水配制，-20保存。过硫酸铵会缓慢分解，一周内使用完。1.4.10 上样缓冲液：0.5mol/L Tris HCl pH6.8 2mL，甘油 2mL，20% SDS 2mL，0.1%溴酚蓝0.5mL，-2-巯基乙醇1.0mL，dd water 2.5mL，室温存放。1.4.11 电泳缓冲液：Tris 7.5g ，甘氨酸36g，SDS2.5g，加ddwater 至500mL。使用时稀释5倍。1.4.12 考马斯亮蓝染色液：考马斯亮蓝 R250 0.25g + 45mL 甲醇+10mL 冰醋酸，用ddwater 定容至100mL 。1.4.13 LB 平板培养基：LB 培养基中含 1.2 %（1.2g/100ml）琼脂，高压灭菌后加入氨苄青霉素至100g/mL，每个培养皿中约 20mL 倒制平板。2. 方法2.1 设计引物PCR引物：2.2 BAP基因的PCR扩增2.2.1 由老师提供pMD-19-T-BAP质粒进行PCR扩增。2.2.2 在 0.2mL PCR微量离心管中按下列剂量配制 50L 的PCR反应体系。PCR体系50L（总）PCR Supermix45L模板质粒1L（已稀释50倍）Primer11LPrimer21Ldd water2L2.2.3 设置 PCR 仪的循环程序： 94 3min 循环30次 94 30s 58 30s 72 1min 72 10minPCR结束后，取9l产物进行琼脂糖凝胶泳。观察是否有预计分子量的主要产物带。注：退火温度: 58，PCR3h。2.3 DH5和BL21(DE3)感受态的制备2.3.1 取2个1.5mL 预冷10 min的无菌微量离心管，做上相应标记。2.3.2 其中一管加入1.0mL BL21(DE3)菌液，另外一管加1.0mL DH5菌液，然后在冰上放置 10min， 5000r/min 4 离心 10min，弃上清。2.3.3 加入 1ml 冰冷的 0.1 mol/L CaCl2溶液，立即在涡旋混合器上混匀，插入冰中静置 30min。2.3.3 4，5000r/min 离心 10min。弃上清液后，用 1mL 冰冷的 0.1 mol/L CaCl2溶液重悬菌体，插入冰中放置 30min。2.3.4 4，5000r/min 离心 10min。弃上清液后，用 200uL 冰冷的 0.1 mol/L CaCl2溶液重悬菌体。2.3.5 在超净工作台内将两种菌按50ul/管分装在1.5ml管内，放于4冰箱待用。2.4 pMD19-T-BAP的构建及转化和检测2.4.1 PCR 产物(BAP)与pMD-19-T （PCR 2.1）载体直接连接阳性PCR产物与pMD-19-T载体（PCR 2.1）连接。在离心管中加入：pMD-19-T连接反应体系10L（总）pMD-19-T vector1LPCR 产物3Ldd water1LSolution 15L在干式恒温气浴中16，连接3 h。(实际操作时考虑到PCR产物浓度不高,故加了4L, 没有加水。)2.4.2 感受态细菌的转化2.4.2.1 将恒温水浴的温度调节到 42。2.4.2.2 从4 冰箱中取出感受态菌，冰浴7min。2.4.2.3 取10 uL连接好的质粒与感受态细菌DH5a混匀，在冰上放置20min。2.4.2.4 于42水浴中90S进行热休克，然后在冰中放置4 min，在超净台上加入300uL LB培养基（不含氨苄青霉素），37振荡培养45 min。2.4.2.5 超净台上取上述转化的混合液150L、200L于新的1.5ml的离心管中，加入40L 20% x-gal，7L 20% IPTG 混匀。2.4.2.6 将上述菌液用涂布棒均匀的涂布在含Amp的LB固体培养基上，37恒温培养过夜。2.4.3 pMD-19-T-BAP的鉴定（提取质粒使用tiangen试剂盒）2.4.3.1 观察菌落生长状态，用10uL枪头挑取3个白菌落分别置于含1.7mL LB培养基中，37摇菌培养8h。2.4.3.2 分别取 1.4mL 的菌液于 1.5mL 离心管中，12000r/min 离心1min，弃上清。2.4.3.3 柱平衡，向吸附柱CP3（吸附柱加入收集管中）加入500l的平衡液BL,12000rmp离心1分钟，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放回到收集管中。2.4.3.4 将留有菌体沉淀的离心管加250ul 溶液 P1悬浮细胞沉淀。2.4.3.5 再向离心管中加250ul溶液 P2温和上下翻转6-8次。2.4.3.6 向离心管中加350ul溶液 P3温和上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀12000r/min离心10min。2.4.3.7 吸取上步中离心上清液并转移到吸附柱，12000r/min离心1min，弃滤液。2.4.3.8 将吸附柱置回收集管中，加500ul 去蛋白液，12000r/min离心1min，弃滤液。2.4.3.9 将制备管置回离心管，加600ul 漂洗液 PW，12000r/min离心1min，弃滤液。2.4.3.10 重复上一步操作。2.4.3.11将吸附柱移入收集管中，12000r/min空柱离心2分钟。2.4.3.12将吸附柱至于干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加60lEB，室温放置2分钟，12000r/min离心2min。 电泳检测：以蓝菌落作对照，电泳检测T4-BAP是否连接并转化成功。点样顺序为：质粒，3个蓝菌落，11个白菌落。2.5 pET-his、pMD19-T-BAP的酶切与回收2.5.1 pET-his、plasmid双酶切2.5.1.1 pET-his质粒 DNA双酶切体系：pET-his质粒DNA双酶切体系：40L（总）pET-his质粒 34LQuick Hind1LQuick Hind1L10 Quick Buffer4 L2.5.1.2 BAP质粒 DNA双酶切体系：plasmid 质粒DNA双酶切体系40L（总）plasmid34LHind1LBamH I1LBuffer4 L2.5.2 pET-his、BAP胶回收2.5.2.1 用 1TAE 和琼脂糖配制 1%回收胶。2.5.2.2 从恒温水浴锅中取出酶切产物，分别加入4uL的10 Loading Buffer终止反应，并混匀。2.5.2.3 pET-his胶回收点样顺序为pET-his空质粒，pET-his大片段（小样），pET-his大片段（大样），pET-his大片段（大样）BAP胶回收点样顺序为pET-his空质粒，BAP的PCR 产物，pMD19-T-BAP小片段（小样），pMD19-T-BAP小片段（大样）2.5.2.4 电泳结束后用电话卡将含有大量酶切产物的泳道切下，EB 染色含小样的胶块。在紫外灯下找到目的 DNA 带，用刀片在目的 DNA带的下上下边缘各切一个小口作为标记。2.5.2.5 将做好切口标记的凝胶与未染色的凝胶原位对齐，根据小胶条上的切口标记估计未染色的胶块上大样的 DNA 酶切产物的位置。2.5.2.6 用刀片切下大胶中 DNA 产物所在的凝胶（尽量不要多余的凝胶），分别转移至一个事先称量过的、灭活的 1.5mL 微量离心管中。再称量后计算出其中胶块的重量。2.5.2.7 再用 EB 染色切除 DNA 以后的大胶，与小胶条并在一起在紫外灯下检查是否已把 DNA 带切走。2.5.2.8 按照 DNA 凝胶回收试剂盒的说明书操作，回收 DNA 酶切产物。2.5.2.8.1 向吸附柱CA2中加入500L 的BL，12000r/min 1min 离心，弃废液，将吸附柱从新回收到收集管中。2.5.2.8.2 将单一的目的DNA条带胶块的离心管中加入3倍体积的溶胶剂PN。2.5.2.8.3 在50水浴锅中放置10 min，中间隔2-3 min轻晃几次，确保胶体完全融化，没有胶体颗粒剩余。 2.5.2.8.4 将上一步所得的溶液（放置室温后）加入吸附柱中，室温放置2分钟，12000r/min离心 1min。2.5.2.8.5 离心后，弃废液。向吸附柱中加入600L，漂洗液pw，12000r/min 60s。弃废液。2.5.2.8.6 重复上步。2.5.2.8.7 空柱离心12000r/min，2min，弃废液。开盖放置，彻底晾干。2.5.2.8.8 将CA2，加入新的ep管中，先加入洗脱缓冲液EB 80L，放置2min。12000r/min 2min。收集DNA洗脱液。2.5.2.9 pET-his 、 BAP gene 胶回收电泳验证 pET-his 胶回收电泳点样顺序为pET-his空质粒，胶回收片段 BAP gene 胶回收电泳点样顺序为pET-his空质粒，BAP的PCR 产物，胶回收片段2.6 pET-his-BAP的构建及转化和检测2.6.1 pET- his -BAP的构建（1）提前将干式恒温仪（或泡沫塑料保温盒里的水）温度调整到 16。（2）取一个高压灭活的 0.5mL 微量离心管，加入如下连接体系：pET-his-BAP连接体系10L（总）pET-his 回收Product 1L(根据所提质粒浓度确定)BAP 回收Product7L10x Ligation Buffer1LT4 Ligase1L 将上述混合液轻轻震荡后再短暂离心，然后置于 16水中保温过夜连接。2.6.2 pET-his-BAP转化BL21（DE3）2.6.2.1 将恒温水浴的温度调到 42。2.6.2.2 从4冰箱中取出一管BL21(DE3)感受态菌，插入冰上。2.6.2.3 加入10L 连接好的pET-his-BAP质粒混合液，轻轻震荡后放置冰上 25min。2.6.2.4 轻轻摇匀后插入 42水浴中90s进行热休克，然后迅速放回冰中，静置 5 min。2.6.2.5 在超净工作台中向上述管中加入300uL LB（不含氨苄青霉素） 培养基轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上 37震荡 45min。2.6.2.6 在超净工作台中取上述转化混合液300ul，混匀后滴到含合适抗菌素(Amp+)的固体 LB 平板培养皿中。从酒精中取出玻璃涂布棒，在火上点燃，熄灭后稍等片刻，待其冷却后轻轻涂布均匀。2.6.2.7 在涂好的培养皿上做上标记，先放置在 37恒温培养箱中约30min 直到表面的液体都渗透到培养基里后，再倒置过来放入 37恒温培养箱中培养过夜。2.7 pET-his-BAP的诱导表达2.7.1 观察平板上菌落生长状态，选择大小合适的单菌落以便后续试验步骤。2.7.2 将LB培养基分装到100ml的三角瓶中，后加入氨苄青霉素（100mL/100L）。2.7.3 将加好（Amp+）的LB培养基分装到灭菌的试管中1.8mL/管2.7.4 挑菌，37摇床中，进行摇菌扩培。2.7.5 质粒提取使用tiangen试剂盒，步骤与2.5.1小提质粒相同。2.7.6 提质粒后进行电泳检测。2.7.7 将LB培养基配制成含0.2%的LB-葡萄糖培养基（Amp+浓度为120g/ml，即100ml/120l的比例加入Amp+）2.7.8 将正确的质粒对应的菌液加入6ml的LB-葡萄糖培养基培养基30，慢摇过夜。2.8 SDS-PAGE检测pET-his-BAP的表达2.8.1 电泳槽的组装及配胶2.8.1.1 组装电泳玻璃并用细橡胶管密封底部和侧面，然后用夹子夹住玻璃两侧的中央部位。插入梳子后在玻璃上距离梳子齿底部 1cm处做一个标记。拔掉梳子，倒入蒸馏水检验是否漏水。如不漏水，弃掉蒸馏水。2.8.1.2 配制 10%分离胶：按顺序和量取下列溶液混在一个 50mL 的小烧杯中：Acrylamide-Bis 3.96ml1M Tris(pH8.8) 4.38ml dd water 3.432ml10% SDS 118.8LTEMED 9.9L10%APS 118.8L2.8.1.3 加完TEMED 后拿起烧杯轻轻转动几下底部，将溶液混匀后，立刻缓缓倒入玻璃夹缝中，直到液面与所作的标记齐平。剩下的胶液留在小烧杯中，倾斜放置。2.8.1.4在胶液面上部用 1000uL 微量移液器轻轻地沿玻璃壁来回移动加满 dd water。静置约 30min。直到烧杯中剩余的胶液凝固。倒出蒸馏水。2.8.1.5 配支持胶：按顺序和量取下列溶液混在一个 50mL 的小烧杯中：Acrylamide-Bis 0.675ml0.5M Tris(pH6.8) 0.563mldd water 3.165ml10% SDS 45LTEMED 7.5L10%APS 45L2.8.1.6 加完TEMED 后拿起烧杯轻轻转动几下底部，将溶液混匀后，立刻倒入玻璃夹缝中，液面与玻璃上边缘齐平。然后再慢慢插入梳子，静置约 20min。烧杯中剩下的胶液倾斜放置，直到其中的溶液凝固。2.8.1.7去掉橡胶管，将装有胶的玻璃和梳子翻转,贴在电泳槽侧面，用夹子把玻璃两边的中部与电泳槽中部夹在一起。2.8.1.8 在上面的槽中加满自来水试验一下是否漏水，然后倒掉自来水。2.8.1.9 配制1X加样缓冲液400mL，从上面的电泳槽倒入，若不从下面的电泳槽漏水，则加满缓冲液，在将下面的电泳槽也加满电泳缓冲液，小心缓慢地拔出梳子。2.8.2 外源基因的诱导表达2.8.2.1 超净台中接种 pET-his-BAP的BL21（DE3）菌 空pET-his转化BL21（DE3）菌 BL21（DE3）空菌。 37摇菌。2.8.2.2 150-170r/min 摇菌，设置时间梯度对比。统一加3lIPTG进行诱导。样品编号时间梯度3，4, 5, 6, 71.5h（a）2h（b）3h（c）2.8.3 各取1.5ml菌液12000rpm离心15min，弃上清，收获菌体。用20uldd water重悬菌体，加入20ul的2加样缓冲液，煮沸5min。2.8.4 电泳泳道设计1-11泳道加样顺序依次为：marker、碱性磷酸酶、IPTG空菌BL2（DE3）、空载体BL21（DE3）。3a、3b、3c、4a、4b、4c、7b。另一电泳泳道设计1-11泳道加样顺序依次为：marker、碱性磷酸酶、IPTG空菌BL21（DE3）、空载体BL21（DE3）。5a、5b、5c、6a、6b、6c、7c。2.8.5 电泳时，15mA恒流电泳。直至到条带到支持胶处，改为20 mA电流电泳。2.8.6 染色考马斯亮蓝染色30min，流水冲掉染料后清水脱色浸泡过夜。3 实验结果与分析3.1. BAP基因的PCR扩增将实验室提供的pMD-18-T-BAP质粒进行PCR扩增，在30个PCR循环中，得到BAP基因的扩增片段，进行琼脂糖凝胶电泳后没有得到条带。而且我们整个在基因工程实验室做实验的同学的PCR电泳均没有条带产生，可能是因为PCR仪有些许的问题，影响了实验结果。因没有条带产生，进而也没有照相。3.2 pET-his的提取，酶切及胶回收检验3.2.1 pET-his的提取，电泳检测，如图1所示图1 3.2.1.1 1-6号样均为质粒提取的结果，本组位于右起第2个泳道。3.2.1.2 实验结果表明提取质粒成功,但是含量不高,分析原因可能是菌体浓度不够,所含质粒数量较少,提取质粒时操作猛烈,导致片段化等。（由于第一次照相的效果不好，结果看得不太清楚。）3.2.2 pET-his酶切结果分析，如图2所示图2 3.2.2.1 左数第一条带为pET-his质粒，2,3为pET-his质粒酶切的大片段（小样）。3.2.2.2此为酶切图谱，小的片段已经跑出凝胶了，我们主要回收大的片段。由小样清晰度来看，酶切成功的含量应该很大。由于未被酶切的质粒呈现超螺旋结构，故电泳时跑的位置靠下。而被酶切的片段呈现线性，跑的速率相对较慢，故呈现上图的情形。图33.2.3 pET-his酶切胶回收电泳检验,如图3所示：3.2.3.1 图中,2号孔代表未被酶切的质粒,3-7号孔代表胶回收的产物3.2.3.2 由于含量很低，照相后无法很清楚的看到条带，在紫外灯下能够看到条带，但很微量不太清晰。3.3 pMD19-T-BAP的构建转化检测 3.3.1 pMD19-T-BAP的构建转化检测。3.3.1.1 用已经扩增好的PCR 产物(BAP)与pMD-19-T （PCR 2.1）载体直接连接。并将连接好的pMD19-T-BAP质粒导入DH5感受态菌中，进行诱导鉴定。将转化的DH5感受态菌，摇菌培养后涂平板。涂到LB(Amp+)的固体培养基中，过夜培养，进行蓝白斑鉴定。将每个平板挑取三个白菌落一个蓝菌落分别加入加了3mlLB(+Amp)的试管中标记，在超净工作台中工作。然后培养3h3.3.1.2 将培养的菌取出按照试剂盒提质粒，后进行电泳鉴定。（我组的电泳结果过于模糊，因而用的别组的照片进行分析） 图4 1为pET-his质粒，2，3,4为蓝菌落所提质粒，5-10为白菌落所提质粒。3.3.1.3 由图可知，5和7号样的连接错误，而6号样出现两个条带可能是因为在挑取菌落的时候挑了两个以上的单菌落，而真正成功连接的为10号样。3.3.1.4 失败的原因可能是菌落太小，在挑取时颜色分辨的不是很清楚；感受态菌体本身有问题；PCR产物有问题；T载体有问题；平板涂布不均匀，连接出现问题等。3.4 pMD19-T-BAP的酶切3.4.1pMD19-T-BAP的酶切结果（借用别组的照片，我们的在紫外灯下看得到微弱的条带，可是在成像仪内照相后看不到条带）图53.4.1.1 1为pET-his质粒，2为PCR产物，3-6为酶切产物。3.4.1.2 3-6中，明显可以看到2条条带，分别为大片段和小片段，本次我们需要回收的为大小和PCR产物相近的小片段。所以采用这些酶切结果进行胶回收。3.5 pMD19-T-BAP胶回收的结果图63.5.1 1为PCR产物，2-5为胶回收产物。3.5.2 我组的产物位于第三泳道，在紫外灯下能够看到条带，可能是由于含量太少，成像仪照相的照片没有条带。3.6 pET-his-BAP的构建及转化和检测图73.6.1 由右到左依次为 1为pET-his质粒，其余皆为连接载体的提取物3.6.2 由图可知，除了marker外，3、4、5、6、7皆有亮度出现，但由于有严重的拖尾现象，所以目前不能确定是否连接正确，但为了后续试验，我组决定扩大培养该五组菌体，然后进行蛋白质检验。出现严重的拖尾现象可能是因为电泳槽的温度太高，导致DNA 片段化，进而出现大范围的拖尾现象，但具体原因尚不明确。3.7 SDS-PAGE检测pET-his-BAP的表达将正确的质粒对应的菌液（上步对应的3、4、5、6、7的菌液）加入6ml的LB-葡萄糖培养基培养基30，慢摇过夜,加入IPTG进行诱导,本组做的为时间梯度,检测如图8所示。 图8分析： 电泳泳道设计1-11泳道加样顺序依次为：marker、碱性磷酸酶、IPTG空菌BL21（DE3）、空载体BL21（DE