体内研究IL-2基因瘤苗抗肿瘤效应_及安全性检测硕士论文.doc

上海交通大学硕士学位论文上海交通大学硕士研究生学位论文体内研究IL-2基因瘤苗抗肿瘤效应及安全性检测The study about ANTI-TUMOR EFFECT AND SAFETY OF IL-2 GENE VACCINE IN VIVO矚慫润厲钐瘗睞枥庑赖。海 研究生姓名：张某某医学院附属瑞金医院普外科指导老师：赵老师学科（专业）：外科学（普通外科学）培养单位：上海交通大学医学院附属瑞金医院攻读学位：硕士学位答辩时间：2008年5月上海交通大学学位论文原创性申明本人郑重申明:所成交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。聞創沟燴鐺險爱氇谴净。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日上海交通大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关的数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。残骛楼諍锩瀨濟溆塹籟。 保密 （ ）， 在 年解密后适用本授权书。本学位论文属于 不保密（ ）。（请在以上括号内打“”学位论文作者签名： 指导教师签名：日期： 年 月 日 日期： 年 月 日3目录中文摘要1酽锕极額閉镇桧猪訣锥。英文摘要3彈贸摄尔霁毙攬砖卤庑。引言6謀荞抟箧飆鐸怼类蒋薔。1 试验材料9厦礴恳蹒骈時盡继價骚。1.1细胞株9茕桢广鳓鯡选块网羈泪。1.2细胞培养9鹅娅尽損鹌惨歷茏鴛賴。1.3杂交试验9籟丛妈羥为贍偾蛏练淨。1.4动物模型9預頌圣鉉儐歲龈讶骅籴。1.5免疫组化9渗釤呛俨匀谔鱉调硯錦。2 试验方法10铙誅卧泻噦圣骋贶頂廡。2.1细胞培养10擁締凤袜备訊顎轮烂蔷。2.2大肠癌基因瘤苗生物活性的鉴定10贓熱俣阃歲匱阊邺镓騷。2.3瘤苗安全性的检测10坛摶乡囂忏蒌鍥铃氈淚。2.4体内实验检测基因瘤苗的抗肿瘤效应。11蜡變黲癟報伥铉锚鈰赘。3 结果13買鲷鴯譖昙膚遙闫撷凄。3.1ELISA检测IL-2蛋白水平得表达13綾镝鯛駕櫬鹕踪韦辚糴。3.2瘤苗细胞的安全性检测结果13驅踬髏彦浃绥譎饴憂锦。3.3体内实验研究瘤苗的抗肿瘤效应15猫虿驢绘燈鮒诛髅貺庑。4 讨 论20锹籁饗迳琐筆襖鸥娅薔。5 结论24構氽頑黉碩饨荠龈话骛。参考文献25輒峄陽檉簖疖網儂號泶。综述26尧侧閆繭絳闕绚勵蜆贅。致谢32识饒鎂錕缢灩筧嚌俨淒。发表论文情况33凍鈹鋨劳臘锴痫婦胫籴。35中文摘要体内研究IL-2基因瘤苗抗肿瘤效应及其安全性检测摘 要目的:本课题研究转导白细胞介素-2（IL-2）基因的人大肠癌细胞瘤苗的抗肿瘤效应及其安全性检测。方法：结肠癌细胞株COLO205采用脂质体法稳定转染IL-2基因， 应用ELISA法检测瘤苗的IL-2的表达，筛选高表达IL-2基因的细胞克隆作为基因瘤苗。将已构造好的结肠癌裸鼠模型分为两组，采用瘤体内注射的方法，注射经60Gy60Co照射的瘤苗细胞（治疗组）和PBS缓冲液（对照组）,密切观察肿瘤生长状况，五周后处死所有裸鼠，取出肿瘤，观察并称重，免疫组化法检测IL-2 基因的表达。把已制备好的大肠癌基因瘤苗用60Co进行照射，将照射瘤苗细胞继续培养，用苔盼蓝染色法测定细胞的存活率，将照射的瘤苗细胞和未照射组的瘤苗进行荷瘤试验。恥諤銪灭萦欢煬鞏鹜錦。结果: 获得基因瘤苗最高表达为COLO205-H5量为139.13 ng/1107/24h。瘤体内注射瘤苗组的裸鼠肿瘤生长缓慢，较早达到平台期，而对照组的肿瘤生长迅速，差异有显著性。（ t=2.7,p0.05）治疗组肿块的重量也明显小于对照组（t=7.2，p0.01）。移植瘤治疗组IL-2免疫组化结果显示阳性，而对照组为阴性,说明了瘤苗在移植瘤体内存活并分泌IL-2。照射60Gy60Co瘤苗细胞培养在25天内全部死亡，荷瘤试验显示照射后的瘤苗未能成瘤，而未经照射组均已成瘤。鯊腎鑰诎褳鉀沩懼統庫。结论:通过体内实验研究证实了IL-2基因转导结肠癌细胞制备的瘤苗具有一定的抗肿瘤效应，经60Gy60Co照射后能消除其致瘤性，为肿瘤的治疗提供了一定的实验基础。硕癘鄴颃诌攆檸攜驤蔹。关键词:大肠癌,白细胞介素-2,基因瘤苗，移植瘤 英文摘要The study about ANTI-TUMOR EFFECT AND SAFETY OF IL-2 GENE VACCINE IN VIVOABSTRACTObjective: To investigate the anti-tumor effect of IL-2 gene vaccine and detect its safety. 阌擻輳嬪諫迁择楨秘騖。 Methods: Eukaryotic expression vectors containing human IL-2 gene was stably transfected into colorectal cancer cell line colo205 by lipofectamine. The clones stably overexpression IL-2 gene were identified by ELISA detection, the clones of highly stably overexpressiong of IL-2 were obtained and used for subsequent test. The athymic nude mice carrying the human colon cancer were subdivided into two groups: treatment groups and placebo groups. The cell clones containing IL-2 gene were irradiated by 60Co(60Gy) and used as treatment group, the phosphate-buffered saline (PBS) administration was used for the placebo group. After 5 weeks, killing all mice , unloading the tumor lump and determining its weight, detecting IL-2 gene expression by using immunohistochemical staining. Proliferative viability of IL-2 gene vaccine irradiated by 60Co (60Gy) was tested by typan exclusion assay in vitro, tumorgenesis capacity of IL-2 gene vaccine irradiated by 60Co(60Gy) was tested in xenograft tumor models in athymic nude mice in vivo.氬嚕躑竄贸恳彈瀘颔澩。 Result: We obtained clones of highly expressing IL-2 gene in colon cancer cell line colo205, and the secretion level of cell clones of highly expressing IL-2 gene was 139.13ng/1107/24h. The nude mice in treatment group show the slower tumor growth and smaller tumor weight compared with those in placebo group(t=2.7,p0.05；t=7.2，p0.01). Immunohistochemical staining shows IL-2 gene overexpression in mice of treatment group while little expression of IL-2 gene in placebo group. The IL-2 gene cell vaccine irradiated by 60Co(60Gy) shows lower proliferative viability and detach the culture plate after 25 days by using typan exclusion method in vitro, the IL-2 gene cell vaccine irradiated by 60Co (60Gy) have little tumorgenesis capacity in nude mice in vivo.釷鹆資贏車贖孙滅獅赘。 Conclusion: We studied anti-tumor effect of colon cancer cell line colo205 transferred IL-2 gene in vivo and its safety detection, our results show the cell vaccine possess some anti-tumor effect and cancer cell vaccine irradiated by 60Co (60Gy) loss its tumorgenesis.怂阐譜鯪迳導嘯畫長凉。KEY WORDS: colorectal cancer, interleukin-2, gene vaccine，xenograft tumor 谚辞調担鈧谄动禪泻類。引言大肠癌是一种常见的恶性肿瘤，近年来发病率呈现逐年升高的趋势。目前，大肠癌的治疗方法主要是以手术为主、辅以局部或全身的放化疗，并有了很高的提高，但50%左右的病人仍然死于转移和复发1。近30年来，随着人类对大肠癌的发生、发展的分子机理不断深入的研究，人类对大肠癌在基因水平上已有深入的研究。大肠癌的发生、发展是一个多步骤，多阶段的复杂过程2，其主要是由癌基因的激活和抑癌基因的失活、DNA修饰功能缺失和机体免疫功能低下等引起的3。大肠癌的基因治疗已取得一定的临床实验疗效，并将被人们更加重视，将会为结直肠癌患临床治疗带来新的选择方法,尤其对出现转移的晚期的大肠癌患者带来福音。嘰觐詿缧铴嗫偽純铪锩。大肠癌的发生、发展经历了多基因、多步骤的过程，其中与环境、饮食、生活习惯和遗传因素协同作用有重要的关系4 5。大肠癌在发生发展过程中经历一系列的基因突变和（或）缺失，造成其不仅在生物学特征方面不同于正常的细胞，而且在免疫学方面也发生显著变化6。如一些基因突变和异常表达，使肿瘤细胞表面出现新的抗原，一些基因缺失或表达下降，造成某些抗原丢失7，这些改变使得肿瘤与机体免疫系统之间曾出现错综复杂的关系：一方面肿瘤细胞表面存在特异性抗原，机体免疫系统能识别这些抗原并产生一系列免疫应答，最终排斥肿瘤8；另一方面，机体免疫系统受包括肿瘤本身在内的许多因素影响，发生免疫耐受，使肿瘤逃避宿主免疫攻击，得以生长并发生侵袭转移9。熒绐譏钲鏌觶鷹緇機库。基因治疗诞生于上世纪80年代末及90年代初，作为一种新兴的治疗手段已正式进入临床试验，恶性肿瘤是主要的候选疾病10。但肿瘤属复杂基因疾病，可能涉及多种基因的异常，发病过程是多阶段多步骤的，至今只有部分基因被鉴定，肿瘤发病的分子机制尚未完全清楚。目前主要存在的障碍有如何选择有效的靶基因、如何实现有效的基因转导11。鶼渍螻偉阅劍鲰腎邏蘞。 基因治疗是从基因水平调控细胞中缺陷基因的表达，修补有缺陷的基因，或以正常基因矫正、替代缺陷的基因，达到治疗缺陷所致的遗传病免疫缺陷；或因癌基因的激活和(或)抑癌基因失活所致的肿瘤等疾病治疗12。目前采用的主要策率有：突变基因的矫正、前提药物的激活、免疫应答的增强、溶瘤病毒等13。纣忧蔣氳頑莶驅藥悯骛。 目前针对大肠癌基因治疗主要有：自杀基因治疗、原癌基因和抑癌基因有关的基因治疗、免疫基因治疗、联合基因治疗14 15，而免疫基因治疗是当前研究的一个热点。无论先天性的还是获得性的免疫反应都被认为机体抗肿瘤重要的机制16。大肠癌细胞具有抗原性，能诱导机体产生免疫应答，但绝大多数肿瘤仍能继续生长并发生转移，说明机体的免疫系统未能发挥抗肿瘤作用。免疫学研究发现，肿瘤抗原尤其是弱抗原在肿瘤长期的刺激下，可作用于不同分化的状态的抗原特异性淋巴细胞，使其处于特异的免疫无应答状态17。无论先天性的还是获得性的免疫反应都被认为机体抗肿瘤重要的机制18。肿瘤细胞还可以通过不表达抗原表位、抗原调变脱落或加工缺陷、缺乏MHC-I类分子或免疫共刺激分子等途径逃避机体免疫系统的攻击。在癌症患者外周血中常出现T细胞亚群的紊乱，表现为CD4细胞（Th）减少，CD8细胞（TcTs）增加，CD4CD8细胞比值下降或倒置，同时NK、LAK细胞也存在不同的程度的活性下降。此外，血清细胞因子谱也常出现紊乱，表现为血清TGF-、IL-10、VEGF、和PEG等细胞因子浓度升高，而IL-2、INF-、GM-CSF和IL-12等浓度的下降19。颖刍莖蛺饽亿顿裊赔泷。人们设想通过免疫调节剂增强肿瘤免疫原性、解除机体免疫耐受，以调整免疫应答达到祛除肿瘤的目的20。肿瘤免疫治疗已有一个多世纪的历史。早期应用灭活的肿瘤细胞、细胞滤过或粗提取物进行主动免疫治疗，但效果不佳。其后应用经物理、化学或生物学方法，如加热、冷冻、放射线治疗、加入神经氨酸酶或病毒等方法，处理肿瘤细胞制成肿瘤疫苗。或将作为佐剂的BCG或BCG-多糖类物质与肿瘤疫苗联合注射。以上方法应用于肾癌和黑色素瘤治疗取得了一定的疗效。此后人们探索将一些外源性基因导入肿瘤细胞，以增强其免疫原性，有利于被机体免疫系统识别，激发特异性细胞毒性反应21。濫驂膽閉驟羥闈詔寢賻。据Wiley网站公布的基因治疗临床试验资料显示恶性肿瘤已成为其主要研究领域，占总方案数的66.2。当前大肠癌基因治疗主要涉及免疫基因治疗、纠正突变的P53基因、抑癌基因的激活和腺病毒介导癌细胞裂解等策略。其中免疫基因治疗约占三分之二，多数采用的策略是经逆转录病毒将细胞因子基因导入肿瘤细胞，制成“瘤苗”，注入患者体内后通过局部分泌细胞因子改变肿瘤微环境，增强宿主的特异性抗肿瘤免疫反应22 23。銚銻縵哜鳗鸿锓謎諏涼。白细胞介素2具有广泛的免疫调节作用，其在结直肠癌的生物治疗中的价值已得到肯定24。IL-2主要有活化的Th1或CD4+T细胞产生25，通过自分泌和旁分泌方式作用于靶细胞，有效地激发宿主特异性抗肿瘤免疫反应（CTL、CD4+和CD8+ ）和非特异免疫反应（NK、LAK、巨噬细胞等）26。临床应用IL-2单用或联合LAK、TIL治疗大肠癌取得了一定的疗效，但其疗效成剂量依赖性，而相应的毒副反应却限制了其大剂量应用27，因此难以充分发挥疗效。挤貼綬电麥结鈺贖哓类。本研究采用逆转录病毒作为载体于体外将外源性的IL-2基因转到至同种异体的人大肠癌细胞株，筛检扩增建立高表达的细胞克隆，建立肿瘤细胞疫苗。在体外检测外源性IL-2基因的整合和表达情况，并冻存于液氮中（本实验小组先前已完成）。复苏基因瘤苗，采用ELISA检测瘤苗的表达IL-2，选用高表达量的细胞瘤苗，作为后续实验使用。基因瘤苗安全性处理采用照射60Co的方法，剂量为60Gy。照射过60Co后基因瘤苗细胞无论在体内还是在体外均失去无限增殖的能力，通过60Co照射灭活了其致瘤性，具有安全性。建立大肠癌动物模型，给予瘤体内注射基因瘤苗细胞，而对照组给予PBS,两组结果对比，在体内进行检测证明转导IL-2基因人大肠癌基因瘤苗的有效性。为IL-2基因瘤苗治疗大肠癌的有效性、安全性提供了重要的试验依据，丰富了大肠癌的基因治疗。赔荊紳谘侖驟辽輩袜錈。1 试验材料1.1 细胞株人大肠癌细胞株SW1116、COLO205和HT-29由本实验组冻存于上海交通大学医学院生化实验室，IL-2基因转导人大肠癌细胞瘤苗SW1116、COLO205、HT-29，由本实验组先前完成并冻存于上海交通大学医学院生化实验室。塤礙籟馐决穩賽釙冊庫。1.2 细胞培养RPMI1640培养液、0.25胰酶、胎牛血清购于GBCO1.3 杂交试验ELISA试剂盒购于Diaclone公司。1.4 动物模型Balb/c裸小鼠24只购于并饲养于中国科学院上海试验动物中心。1.5 免疫组化兔抗人IL-2基因的多克隆抗体 和HRP标记的羊抗兔抗体购于Sigma公司。2 试验方法2.1 细胞培养大肠癌细胞系及肿瘤疫苗细胞培养于1640基础培养液中，含10%的胎牛血清的，于37，5%CO2，相对湿度为90%的培养箱中培养。定期换液和细胞计数。裊樣祕廬廂颤谚鍘羋蔺。2.2 大肠癌基因瘤苗生物活性的鉴定抗体夹心ELISA法检测IL-2表达（蛋白质水平检测）各细胞克隆培养上清样品在室温下解冻，适当稀释，按说明书配置各试剂，取待测样品、标准液及对照液各100ml分别加入96孔反应板微孔内，于各孔内加入50ml生物素标记的抗IL-2检测抗体，室温下孵育1小时，漂洗3次。加入100ml链球菌素亲和素辣根过氧化物酶溶液，室温下孵育30分钟，漂洗3次。加入100ml显色剂TMD,避光孵育15分钟后加入100mlH2SO4溶液终止反应，立刻上酶标仪检测。根据标准样品的不同稀释的浓度及相应的OD值作标准曲线，查看所侧细胞上清样品的IL-2分泌量，用Excel完成。挑选稳定高表达的细胞克隆作为后继的动物试验所用的瘤苗。仓嫗盤紲嘱珑詁鍬齊驁。2.3 瘤苗安全性的检测2.3.1 照射60Co对基因瘤苗细胞生长的影响胎盘蓝排斥试验测定细胞的存活率将照射后的瘤苗细胞用1 x PBS洗2次，025胰酶消化，然后用1ml完全新鲜培养液悬浮，取4滴于载玻片上，用苔盼蓝染色染色23分钟，细胞中深蓝色颗粒浸润即为死亡细胞，透亮的则为活细胞。4滴样品各随机取视野计算100个细胞，细胞存活率=活细胞数100。把4个数值平均，即为某一天细胞的存活率，总细胞数x存活率即得某天的活细胞数。绽萬璉轆娛閬蛏鬮绾瀧。2.3.2 基因瘤苗荷瘤试验把基因瘤苗按是否照射60Co，分为两组：照射组和未照射组，注射瘤苗细胞悬液于裸鼠侧背部皮下，进行荷瘤试验，每组六只裸鼠，密切观察两组裸鼠生长状况，看是否长出移植瘤（具体的步骤见下面“裸鼠移植瘤模型的建立”）。实验分两组：照射60Co转染IL-2的COLO205瘤苗细胞组和照射60Co转染IL-2的COLO205细胞组,每组6只裸鼠，共12只。骁顾燁鶚巯瀆蕪領鲡赙。2.4 体内实验检测基因瘤苗的抗肿瘤效应。2.4.1 结肠癌细胞系COLO205裸鼠移植瘤模型的建立1) Balb/c裸小鼠12只，鼠龄45周，体重1525g，购于中国科学院上海实验动物中心。裸鼠饲养于无菌室层流架无特定病原体(SPF)环境中，给予高压灭菌的水和饲料自由食用。瑣钋濺暧惲锟缟馭篩凉。2) COLO205大肠癌细胞生长至亚融合状态时，弃完全培养液，PBS洗涤3， 0.05%typsin/0.02% EDTA消化成单细胞悬液，800 rpm5 min，4离心；用PBS重悬细胞，细胞数调整至1108/ml。鎦诗涇艳损楼紲鯗餳類。3) 在每只裸小鼠侧背部皮下注射肿瘤细胞悬液50l(5106细胞)。4) 待移植瘤直径达到0.5cm左右时，实验分为两组：治疗组和对照组。应用我们制备的转导了IL-2基因的COLO205瘤苗对肿瘤组织行瘤内注射，对照组注射PBS。栉缏歐锄棗鈕种鵑瑶锬。2.4.2 基因瘤苗治疗移植瘤把制备好经检测高表达的转染IL-2人大肠癌COLO205细胞基因瘤苗进行复苏，复苏后基因瘤苗细胞存活率达到80%以上，待细胞生长至亚融合状态，进行安全型处理后（用60Gy60Co照射)为治疗组，对照组为PBS。当荷瘤裸鼠移植瘤直径达0.5cm左右时,进行治疗试验。治疗组向移植瘤内注射基因瘤苗（细胞量大约为1107个/每只裸鼠，制成细胞悬液），对照组为PBS,两组液体体积相等，每隔1周注射一次。从首次注射之日起密切观察两组裸鼠生长状况，每隔3天用游标卡尺检测肿瘤长径和短径，计算并比较肿瘤的体积。计算公式为肿瘤体积：V=(长径短径)/23/6。两组间体积比较采用t检验，EXCEL 、SPSS11.5完成。辔烨棟剛殓攬瑤丽阄应。2.4.3 移植瘤的处理观察5周后处死小鼠，解剖裸鼠，取出肿瘤称重，OCT包埋，冰冻切片机切片，免疫组化检测IL-2的表达。两组间重量比较采用t检验，SPSS11.5完成。峴扬斕滾澗辐滠兴渙藺。免疫组织化学检测：1) 冰冻切片经冷丙酮室温固定30分钟后，TBS洗5分钟。2) 0.6的H2O237孵育20分钟，以去除内源性的过氧化物酶活性。3) TBS洗5分钟，1:20正常羊血清37封闭30 min。4) 加入一抗37孵育2h。5) TBS洗3遍后加入HRP标记的二抗37孵育1h，6) TBS洗3遍，DAB显色，显微镜下控制显色时间，约5-10分钟，苏木素衬染细胞核后封片观察。3 结果3.1 ELISA检测IL-2蛋白水平得表达 ELISA检测IL-2蛋白水平得表达结果如表1表示。其中IL-2表达最高的克隆是编号为COLO205-H5混合克隆，表达量为139.13 ng/1107/24h，表达最高的单克隆编号为COLO205-11，表达量为129.23 ng/1107/24h，平均表达量为61.51 ng/1107/24h。未转染IL-2的三个结肠癌细胞株培养液上清中均未检测到IL-2的表达。詩叁撻訥烬忧毀厉鋨骜。细胞株总体IL-2表达克隆数 范围 平均值单克隆IL-2表达克隆数 范围 平均值混合克隆IL-2表达克隆数 范围 平均值SW11621 028.31 8.321 028.31 8.3 / / /HT-2924 1.8938.27 15.1922 1.89 38.27 15.792 9.3210.63 10.23COLO20516 0139.13 61.5111 0129.23 59.435 24.12139.13 64.25表1 基因转导大肠癌细胞株IL-2的表达情况（单位：ng/1107/24hr）(schedule 1 state of gene transducted colorectal cancer cell strain express IL-2 unity：ng/1107/24h)则鯤愜韋瘓賈晖园栋泷。 3.2 瘤苗细胞的安全性检测结果3.2.1 照射60Co对瘤苗细胞活力的影响经60Co照射后基因瘤苗细胞体外培养，发现随天数的增加，细胞存活率下降，活细胞数减少，照射后一周内细胞的存活率约为50，25天内基因细胞瘤苗全部死亡，结果见表2（同种细胞两株细胞的活力检测的结果）。上述结果表明照射后的细胞活力明显下降，在第15天时候细胞几乎全部死亡，因此，经60Co照射后瘤苗细胞已经失去了肿瘤性的无限增殖能力，失去了致瘤性。胀鏝彈奥秘孫戶孪钇賻。 剂量 天数60Gy1 3 6 8 10 13 15 20 25 存活率（） 100 97 53 28 8 2 0.3 0.06 0 100 95 52 25 5 1 0.2 0表2 照射60Co对瘤苗细胞活力的影响(schedule 2 influence of radiation tumor vaccine with 60Co)鳃躋峽祷紉诵帮废掃減。3.2.2 体内实验检测瘤苗的安全性未照射60Co基因瘤苗组在第16天出现了肿瘤，而照射组未能成瘤,见图1。体内和体外实验均说明了我们应用60Co处理过瘤苗细胞已失去肿瘤细胞的无限增殖的能了，失去了致瘤性，用来治疗肿瘤是安全可行的。稟虛嬪赈维哜妝扩踴粜。 A 未照射60Co B 照射60Co 图1 两组瘤苗细胞的荷瘤实验结果(graph 1 result of two group tumor vaccine cell bearing tumor )陽簍埡鲑罷規呜旧岿錟。3.3 体内实验研究瘤苗的抗肿瘤效应3.3.1 治疗组给予基因瘤苗后移植瘤生长速度明显慢于对照组，对照组裸鼠生长状态较差，肿瘤体积不断增大，在第31天时已有2只裸鼠不能耐受而死亡。治疗组裸鼠生长状况较为良好，在第22天时肿瘤生长已经达到平台期。在第31天时处死所有裸鼠，取瘤称重。从治疗之日起，移植瘤的生长曲线见图2，两组间体积比见表3。处死裸鼠后取肿瘤，两组间移植瘤重量的比较见表4。沩氣嘮戇苌鑿鑿槠谔應。图2.移植瘤生长曲线(graph 2 growth curve of transplantation tumor)时间点（每隔3天） 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11治疗组（裸鼠的平均体积） 785 980 1134 1258 1431 1569 1892 2051 2154 2167 2181对照组（裸鼠的平均体积） 821 1121 1457 1793 2234 2794 3685 4005 4451 4921 5011t=2.7 P0.05表3. 移植瘤体积比(schedule 3 volume ratio of transplantation tumor)钡嵐縣緱虜荣产涛團蔺。组 别 1 2 3 4 5治疗组 0.33 0.5 0.61 0.53 0.47对照组 1.05 1.75 1.35 1.40 1.30t=7.2 P0.01 表4 移植瘤重量比(schedule 4 weight ratio of transplantation tumor)懨俠劑鈍触乐鹇烬觶騮。3.3.2 移植瘤的免疫组化肿块经OCT包埋制成冰冻切片后进行免疫组织化学检测。结果显示治疗组移植瘤内IL-2表达呈强阳性，而对照组移植瘤内IL-2为表达为阴性，见图3。说明基因瘤苗在移植瘤内存活，并能继续分泌IL-2。謾饱兗争詣繚鮐癞别瀘。 A 对照组 B 治疗组 图3. 两组间的组免疫组化(graph 3 immunohistochemistry of two groups ) 4 讨 论大肠癌是一种常见的恶性肿瘤，近年来发病率呈逐渐升高的趋势，对人类的生命构成了极大的威胁。据美国癌症协会2007年报告显示，美国的大肠癌发病率居于恶性肿瘤发病率中居第三位。我国内结直肠癌的发病率也呈逐年上升趋势，位于消化道肿瘤的第二位，每年新发病人数约为1316万，死亡人数约为69万，多发于大中城市。上海地区2005年统计数据显示大肠癌发病率达40.8人/10万，其中每年新增病例3000余例，大肠癌发病已成为第二位高发肿瘤。呙铉們欤谦鸪饺竞荡赚。近年来随着电子结肠镜、吻合器和新型化疗药物的临床应用，以及全直肠系膜切除术的推广和新型放疗技术的改进，大肠癌综合诊治水平得到了显著的提高28，总体五年生存率达50左右29。但欲进一步提高疗效，甚至彻底攻克恶性肿瘤这一顽症，尚需借助于免疫基因治疗新型治疗方式30。莹谐龌蕲賞组靄绉嚴减。IL-2具有广泛的免疫调节作用而在大肠癌治疗中得以广发应用。West WH31等阐明体外给予IL-2时有一定的生理阈值，即1.810IU/m2d,低于此值则无抗肿瘤活性，而达此“阈值”后IL-2的输注剂量越高，其效果越好，然而单一IL-2治疗大肠癌疗效并不理想。利用IL-2与其他化疗联合应用，应用免疫疗法，在大肠癌病人中取得了较好的疗效32 33。但无论是全身还是局部给药，作为药物体外给予的IL-2只能按照药代动力学规律吸收、分布和代谢、不可能具备生理状态下比分泌或旁分泌的作用模式34。由于血管渗漏和淋巴细胞渗透导致的严重的毒副反应限制了给药剂量，使用常规治疗方式难以在肿瘤局部达到有效的浓度35。麸肃鹏镟轿騍镣缚縟糶。肿瘤疫苗从20世纪80年代末和90年代初以后，肿瘤疫苗走向临床研究和应用开发，并已成为国际上肿瘤免疫治疗的热点，其中基因修饰的疫苗成为目前研究的热点。其就是应用基因重组技术将目的基因导入肿瘤细胞制备而成的肿瘤细胞疫苗36。Wang XY37等，通过能表达热休克蛋白的cDNA转导入鼠源性CT-26大肠癌细胞，来表达增强其免疫原性，并联合使用GM-CSF，抑制了移植瘤（CT-26细胞）的生长，显示其抗肿瘤效应。Lyons JA38等利用重组体塞姆利基森林病毒颗粒为载体编码了鼠源性的血管生长因子受体-2，治疗裸鼠移植瘤（CT-26细胞），进行血管密度分析显示免疫接种疫苗的抑制肿瘤的血管反应，从而达到抑制肿瘤的生长。納畴鳗吶鄖禎銣腻鰲锬。采用以缺陷型逆转录病毒为载体，将IL-2基因转染至细胞，建立细胞瘤苗。输入机体后，在肿瘤的局部持续分泌一定剂量的IL-2，有利于肿瘤抗原局部达到有效浓度，增加肿瘤免疫原性，动员T、B淋巴细胞、NK细胞和巨噬细胞等效应细胞聚集，并诱导其分化成熟，产生抗肿瘤免疫反应。同时避免了大剂量的IL-2使用，减少了IL-2的毒副反应。研究表明肿瘤细胞转导IL-2基因可增加血管生成，有利于免疫效应的细胞侵润39。同时可以转导多药耐药基因并联合细胞毒性药物联合使用，产生较好的协同效应40。在体外转导IL-2基因的鼠源性的大肠癌细胞，而制成的肿瘤疫苗，治疗移植瘤研究表明瘤苗能抵御亲本肿瘤细胞的攻击，延缓肿瘤细胞的攻击，延缓了肿瘤的发展和扩散41 42。Sobol RE43等用缺陷性逆转录病毒为载体把IL-2基因转染到成纤维细胞中，建立了细胞瘤苗。在临床实验中，将瘤苗和已处理过的肿瘤细胞混合种植于皮下。5例病人中有4例中出现了T细胞增多。但就疗效而言，并未出现临床缓解病例。由于样本数较少，需进一步研究加以验证。安全性采用60Co照射后，转导细胞尚能持续分泌细胞因子长达23周，但致瘤性消失44，采用60Gy60Co照射后的基因瘤苗细胞，继续培养，一周内瘤苗细胞大约存活50%，25天内全部死亡，而基因瘤苗细胞的分泌在照射后24小时稍增加，而给予皮下注射1107瘤苗细胞量的注射，未出现毒副反应45。为基因瘤苗的利用提供安全性保障。同时基因瘤苗经过照射后，增强了生物活性。風撵鲔貓铁频钙蓟纠庙。本研究在本课题组完成瘤苗建立和体内生物学检测的基础的上，继续完成后继的试验。由于前期试验已完成的相应的瘤苗，已储存一段时间，所以在体内检测之前，对以复苏瘤苗细胞进行ELISA检测，来选择高表达的基因瘤苗细胞进行后继的动物试验。经检测，转染IL-2基因的混合克隆大肠癌瘤苗细胞COLO205-H5的表达量最高。建立大肠癌裸鼠模型（COLO205细胞），选用经检测的最高表IL-2的大肠癌细胞株，进行安全处理后（采用60Gy60Co照射），制成细胞悬液向瘤体内注射，对照组用PBS，经照射后的瘤苗细胞一周内的存活率约为50%，15天内几乎全部死亡，所以我们采用每隔一周进行一次治疗，观察肿瘤生长情况，描绘肿瘤生长曲线。明显得出，治疗组的移植瘤生长比对照组生长缓慢，明显显示了肿瘤疫苗的抗肿瘤效应。安全性处理采用给予肿瘤疫苗照射60Co，量为60Gy，继续进行细胞培养，测定照射60Co对细胞活性的影响，采用苔盼蓝排斥试验测定细胞计数，一周内瘤苗细胞存活约为50%，约为25天全部死亡，得出瘤苗细胞在体外经60Co照射后失去无限增殖的能力。瘤苗细胞进行裸鼠荷瘤试验，结果照射组未长出肿瘤，而未照射组则长出肿瘤。从这两方面我们明显得出，给予肿瘤疫苗照射60Co，基因瘤苗失去了致瘤性，失去在体外无限增值的能力，而没有改变其生物学活性，达到了安全性处理的目的。灭嗳骇諗鋅猎輛觏馊藹。本试验成功地在体内证实了IL-2基因转导人大肠癌细胞肿瘤疫苗抗肿瘤的有效性，采用60Co照射后的肿瘤疫苗是具有安全性的。为IL-2基因瘤苗人大肠癌的临床试验及应用提供了一定方法借鉴，奠定了试验基础。由于这是一种处于探索阶段的治疗方法，还有一些需要继续解决的问题，如给药的剂量、方法、肿瘤本身免疫性逃避改变等。本课题组采用的同种异体的大肠癌细胞株作为前提细胞，避免了大肠癌元代培养的困难，简化了瘤苗的治疗，有利于临床的引用,尤其适用于无法通过手术取得肿瘤细胞的晚期大肠癌肿瘤细胞的晚期病人。但本课题组将于后继的试验中继续探索大肠癌细胞体外原代培养的成功方法，减少污染，提高成功率，以便建立个体化的大肠癌细胞瘤苗，提高特异性，增加疗效。同时由于大肠癌的形成是多基因、多步骤的过程，所以我们考虑联合其他基因治疗的方法，如联合其他的细胞因子，以及抑癌基因，来探索更有效的大肠癌的生物治疗。铹鸝饷飾镡閌赀诨癱骝。5 结论在蛋白质水平上检测了IL-2基因修饰的瘤苗的高表达性，建立了大肠癌动物模型，在体内检验了肿瘤疫苗抗肿瘤的有效性。在细胞和荷瘤试验两方面证明了采用60Co照射后的肿瘤疫苗是具有安全性的。为肿瘤疫苗的临床试验以及临床应用奠定了基础。攙閿频嵘陣澇諗谴隴泸。参考文献综述大肠癌基因治疗的现状及展望 上海交通大学医学院附属瑞金医院普外科（200025） 张治进 综述 赵任 审校 摘要：大肠癌常规治疗方法为手术为主，辅以局部或全身的放化疗，但病人的年的5年生存率不高。基因治疗是一种新型的治疗肿瘤的方法，基因治疗大肠癌是一种有效的治疗方法。将会成为一种很受临床欢迎的治疗大肠癌的方法。本文针对大肠癌的基因治疗进行综述。趕輾雏纨颗锊讨跃满賺。 关键词：大肠癌；基因治疗 一直以来，大肠癌发病率在我国恶性肿瘤病率中处于很高的发病率，并有增高的趋势。近30年来，随着人类对大肠癌的发生的的分子机理不断深入的研究，人类对大肠癌在基因水平上已有深入的研究。大肠癌的发生、发展是一个多步骤，多阶段的复杂过程，其主要是由癌基因的激活和抑癌基因的失活、DNA修饰功能缺失和机体免疫功能低下等引起的。目前，大肠癌的治疗方法主要是以手术为主，辅以局部或全身的的放化疗，但未能明显提高大肠癌的五年生存率。随着分子生物学技术的迅速发展及对大肠癌发病、发展机制的进一步深入研究，大肠癌的基因治疗已取得一定的疗效，并将被人们更加重视，将会成为一种大量应用于临床的肿瘤治疗方法。夹覡闾辁駁档驀迁锬減。大肠癌基因治疗策略的现状及进展1.1细胞因子的基因治疗：细胞因子的基因治疗法就是将细胞因子的基因在体外导入受体细胞后，再回输机体或直接将细胞因子导入体内肿瘤的微环境中产生细胞因子，激活抗肿瘤的免疫反应，从而达到抗肿瘤的效果，目前常用的大肠癌细胞因子主要包括白细胞介素112(IL1-12),干扰素、（INF、），肿瘤坏死因子（TNF），粒细胞集落刺激因子（GM-csf）等。Chikkanna等1应用IL-12基因治疗大肠癌CT26裸鼠荷瘤模型后，增强T细胞等免疫细胞的抗肿瘤功能。Kudo-Saito C等 2报道白细胞介素12（IL-2）偶联rF-GM-CSF治疗能显著增强抗肿瘤效应，联合治疗组瘤体体积比单独治疗组（白细胞介素12治疗）显著减小，肿瘤生长缓慢，转移减少，裸鼠带瘤存活期延长。为白细胞介素12（IL-12）治疗细胞因子基因治疗大肠癌提供了理论的可行性，给临床利用白细胞介素细胞因子治疗大肠癌提供了实验依据。Zhao等3报道ZD55-IL-24基因治疗结肠癌使肿瘤细胞凋亡率显著增加，而正常细胞不受影响。比传统的ONYX-015或Ad-IL-24治疗有更好的疗效，ZD55载体介导的IL-24显示出更强的抗肿瘤效应。J ALyons等4将VEGFR-2基因利用塞姆利基森林病毒为载体转染入CT26大肠癌细胞，体内实验发现接种转染细胞的裸鼠肿瘤血管密度显著降低，肿瘤增长缓慢，其机制可能是转染大肠癌细胞分泌的VEGFR-2竞争抑制了VEGF与血管内皮细胞的VEGFR结合。由此可见细胞因子基因治疗大肠癌具有较好的疗效，并且具有一定的靶向作用，毒副作用小等优点，也可以为术后辅助治疗提供更好的方法，显示其优越的临床价值。视絀镘鸸鲚鐘脑钧欖粝。 1.2 癌基因和抑癌基因的治疗：癌基因是人体细胞固有的基因，其表达的产物为生理状态下正常细胞增殖分化所必需的，在一定的条件下被激活，呈现在时间和空间上的差异表达，可导致细胞增殖分化过程失衡而引起细胞恶变，针对癌基因的过度活化可用反义寡核苷酸和（或）核酶抑制癌基因。Durai 等5将胰岛素样生长因子结合蛋白-4（IGFBP-4）导入大肠癌HT-29荷瘤模型内，IGFBP-4治疗组较对照组，Bax表达增加，Bcl-2 表达下降，肿瘤细胞凋亡增加，血管密度降低，有效的抑制了裸鼠移植瘤的生长。Ras基因在大肠癌中约有50%的突变率，所以选择性针对Ras基因突变的肿瘤治疗有一定价值。Dvory等6构建了三组Ras突变型的结肠癌模型，分别是R1，SW480和HCT116。然后将携带Bax,caspase-8和PKG的基因导入到上述肿瘤细胞内，有效地抑制了肿瘤的形成。选择性的过表达前凋亡基因对Ras基因突变的结肠癌有很好的抑制作用，而正常组织的细胞生长不受影响。因此，这种基因疗法对Ras 突变的大肠癌临床治疗有一定的指导意义。Lledo S等7应用反义核算技术将anti-k-ras 和antitelomerase 寡核苷酸注入结肠癌细胞SW480内，有效地抑制了肿瘤细胞的增殖，其抑制效果取决于寡核苷酸的类型，剂量和作用时间，在剂量为20mM作用48小时后，细胞活力下降了99.67%。反义K-ras 和端粒酶的结合协同增强了肿瘤的抑制效应，为临床治疗提供了一定的实验依据。抑癌基因又叫隐性癌基因、抗癌基因、肿瘤易感基因。这类基因在控制细胞生长、增殖及分化过程中起着十分重要的负调节作用，并潜在抑制肿瘤生长。如果功能缺失、突变等异常可导致恶性转化而发生肿瘤。因此我们可以通过恢复抑癌基因的功能来抑制肿瘤的发生、发展，一般将具有正常功能的野生型的抑癌基因（P53、P16、Rb等）利用各种途径转染至肿瘤细胞内，重建失活得癌基因的功能，从而达到抑制肿瘤的细胞异常生长的目的。P53的突变可见于50%的结肠癌患者。因此改善P53的功能对结肠癌的治疗显得尤为重要。Rayburn等8发现TLR9（toll-like receptor 9）激动剂可促进结肠癌细胞的凋亡，提高癌细胞对放，化疗的敏感性，这与其改善P53的功能相关，TLR9可作为未来结肠癌临床治疗的候选药物。Aizu 等9发现p53的负性调节因子Mdm2的抑制剂Nutlin-3可激活野生型的p53的表达，进而诱导了凋亡基因Bax和PERP的表达，促进了G2/M期阻滞，抑制肿瘤生长。Nutlin-3 为临床无P53突变的结肠癌的治疗提供了一定的实验依据。偽澀锟攢鴛擋緬铹鈞錠。1.3 自杀基因治疗：一些病毒或细菌的基因产物可将无毒或极低毒性的药物前体转化为毒性产物，导致细胞死亡，这类基因被称为自杀基因。其治疗原理将自杀基因导入某一细胞，表达并生成特定酶类，转化无毒或极低毒药物前体为毒性产物，从而发挥抗肿瘤作用。WolfgangWalther10等在大肠癌细胞的裸鼠荷瘤模型（CoLo5734和SW480）体内注射CD自杀基因，在治