TRIZOL法提取总RNA.ppt

实验总体安排1 大鼠GAPDH基因的钓取 克隆和鉴定 大鼠肝细胞总RNA的提取 凝胶电泳检测GAPDH基因的RT PCR扩增 普通聚合酶 RT PCR产物的胶回收连接入T载体 转化 GAPDH基因的TA克隆 挑单克隆 摇菌过夜 提质粒酶切鉴定 电泳检测 专题 2 humanIL8ELISA检测3 报道系统的单光子检测 TRIZOL法提取总RNA 简介 研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA RNA质量的高低常常影响cDNA库 RT PCR和NorthernBlot等分子生物学实验的成败 Trizol是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂 内含异硫氰酸胍 酚等物质 异硫氰酸胍能迅速溶解蛋白质 导致细胞结构破碎 核酸由于核蛋白二级结构的破坏而解离下来 异硫氰酸胍同时抑制细胞释放出的核酸酶 保持RNA的完整性 在酚和氯仿作用下离心 样品分成水样层和有机层 RNA存在于水样层中 收集上面的的水样层后 用异丙醇沉淀火的RNA RNase 它广泛存在于人的皮肤上 因此 在与RNA制备有关的分子生物学实验时 必须戴手套 RNase的又一污染源是取液器 包括枪头和EP管等 RNase处理 所有玻璃器皿均应于使用前180 干烤3h或更长时间 塑料器皿可用0 1 DEPC浸泡或用氯仿洗涤 全部实验过程最好戴一次性手套 接触可能污染了RNA酶的物品后 应更换手套 配制的溶液应尽可能用0 1 DEPC在37 处理12h以上 然后高压灭菌除去残留的DEPC 不能高压灭菌的试剂 用经DEPC处理过的无菌蒸馏水配制 然后用0 22um滤膜过滤除菌 从组织中提取RNA 本实验目的 提取大鼠总RNA组织来源 大鼠肝脏 每组做两个样品 步骤 解剖大鼠肝脏 每个样品取50 100mg组织 立即加入1mlTRIZOL试剂 匀浆 移入1 5mlEp管中 室温静置5min 每1mlTRIZOL中加氯仿0 2m1 摇振15s 置室温2 3min 4 离心 12 000g 15min 仔细吸取上层水相 移至另一Ep管中 加0 5ml异丙醇 混匀 置室温10min 4 离心 12 000g 10min 弃上清 加75 乙醇1m1 轻轻摇振 充分洗涤沉淀 4 离心 7500g 5min 弃上清 空气干燥5 10min 加入50 l无RNase水重悬沉淀 核酸定量或电泳检测 多余样品 70 保存备用 注意事项 抽提及操作RNA中要谨防RNase的污染 因此操作RNA的试剂及器皿都要进行相应的处理 全部实验过程最好戴一次性手套 接触可能污染了RNA酶的物品后 应更换手套样品量和Trizol的加入量一定要按步骤 1 的比例 不能随意增加样品量或减少Trizol量 否则会使内源性RNase的抑制不完全 导致RNA降解 电泳检测 琼脂糖凝胶电泳是检测和分离核酸的常用方法琼脂糖是一种天然聚合长链状分子 可以形成具有刚性的滤孔 凝胶孔径的大小决定于琼脂糖浓度 DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷 在外加电场作用下向正极泳动 琼脂糖凝胶电泳法分离DNA 主要是利用分子筛效应 迁移速度与分子量的对数值成反比关系 因而就可依据DNA分子的大小使其分离 该过程可以通过把分子量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测 溴化乙锭 EB 为扁平状分子 在紫外光照射下发射荧光 EB可与DNA分子形成EB DNA复合物 其荧光强度与DNA的含量成正比 据此可粗略估计样品DNA浓度 注意事项 EB是致癌物质 切勿用手接触 更不要污染环境 实验过程中操作要保持安静 镇定 注意样品不能混样 实验步骤 1 0 25g琼脂糖加入25ml1 TAE电泳缓冲液中 摇匀 在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解 2 冷却到60 加入1 l的0 5mg mlEB 并摇匀 3 将将制胶板两端封好 插入适当梳子 将溶解的琼脂糖 约50 倒入 室温冷却凝固 4 将凝胶置入电泳槽中 加1 TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1 2mm 小心垂直向上拔出梳子 5 用移液器吸取总RNA样品5 l于封口膜上 再加入1 l的6Xloadingbuffer 混匀后 小心加入点样孔 6 打开电源开关 调节电压至3 5V cm 可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动 电泳约30min 上样 预染色的标本 电泳检测结果 RNA提取 关键防止RNA降解 RNA提取的成功与否是RT PCR检测中最重要的步骤 核酸定量 组成核酸分子的碱基 均具有一定的吸收紫外线特性 最大吸收波长为250 270nm之间 例如腺嘌呤的最大紫外线吸收值在260 5nm 胞嘧啶 267nm 鸟嘌呤 276nm 胸腺嘧啶 264 5nm 尿嘧啶 259nm 这些碱基与戊糖 磷酸形成核苷酸后 其最大吸收峰不会改变 但核苷酸最大吸收波长是260nm 吸收低谷在230nm 这个物理特性为紫外分光光度法测定核酸溶液浓度提供了基础 在波长260nm紫外线下 1OD值的光密度相当于双链DNA浓度为50ug ml 单链DNA或RNA为40ug ml 单链寡核苷酸为20ug ml DNA样品的浓度为 OD260 核酸稀释倍数 50 1000 ug ul RNA样品的浓度为 OD260 核酸稀释倍数 40 1000 ug ul 故根据OD260 OD280的比值可以估计核酸的纯度 DNA样品的比值为1 8 RNA样品的比值为2 0 若DNA样品的比值高于1 8 说明样品中含有RNA污染 若RNA样品比值高于2 0 则提示RNA有降解 RNA DNA溶液中含有酚和蛋白质将导致比值降低 实验步骤 取适当体积 2ul 核酸样品 加水或 TE 至100ul 混匀 将核酸定量仪调制RNA测定一项 输入稀释倍数 然后把样品放入核酸定量仪中读数 核酸定量仪将直接给出样品浓度 RT PCR RT PCR RNA的多聚酶反应 RT PCR 是以mRNA为模板进行逆转录反应 reversetranscription RT 与PCR 可用于检测单个细胞或少数细胞中少于10个拷贝的RNA模板 反转录PCR RT PCR OligodT 逆转录酶 用途 获得所需cDNA片段 检测基因表达 RNA 缓冲液 dNTP 逆转录酶 引物 随机引物 OligodT 1 逆转录 实验步骤 取1 g总RNA于一PCR管 70 反应10min 轻轻离心后置于冰上 2 建立20 lRT反应体系 MgCl24 l10 RT缓冲液2 ldNTPMixture 10mM 2 l 1 25mmol L RNaseinhibitor0 5 l逆转录酶1 l 200U Oligo dT 15引物1 l总RNA1 g加无核酶水至总体积20 l涡旋混匀 42 反应15分钟 95 加热5分钟 0 5 5分钟 2 PCR cDNA 缓冲液 dNTP rTaq 引物 特异引物 Mg2 实验步骤 建立PCR反应体系 RT获得逆转录反应得到的cDNA5 l5 0 M的GAPDH混合引物2 l10 PCRbuffer5 l10mMdNTPs1 lTaqDNA聚合酶0 5 lMgCl24 lddH