Urocortin通过L型钙通道抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖活力.doc

Urocortin通过L-型钙通道抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖活力本课题为江苏省卫生厅教育研究室科研项目（J200410）。罗惠媛1，2，陶金1（1南京医科大学药理系 2. 江苏省扬州环境资源职业技术学院医学系）摘要 目的:探索Urocortin对大鼠血管平滑肌细胞增殖活力抑制作用的机制。方法:分离、培养大鼠血管平滑肌细胞，加入不同浓度的UCN以及药物培养，运用MTT法实验，观察UCN对血管平滑肌细胞增殖活力的抑制作用及相关机制。结果:UCN能够浓度依赖性地降低大鼠血管平滑肌细胞的活力，且UCN 能抑制Bay K8644对细胞活力的增强作用。结论:UCN通过阻断L-型钙通道而浓度依赖性地抑制血管平滑肌细胞的增殖活力。关键词 Urocortin 血管平滑肌细胞（VSMC） L-型钙通道 MTT法INHIBITION OF UROCORTIN ON THE VIABILITY OF ADULT RAT VASCULAR SMOOTH MUSCLE CELLS VIA L-TAPE CALCIUM CHANNELSLUO Hui-yuan1,2， TAO Jin1( 1. Department of Pharmacology, Nanjing Medical University, 210029; 2. Medical Department, Yangzhou environment and resources vocational college )Abstract: Objective：To investigate the mechanisms of urocortin(UCN) on the viability of adult rat vascular smooth muscle cells(VSMC). Methods：Rat aortic VSMC were isolated from rats thoracic aorta .VSMC treated with different concentrations of UCN and other drugs. By using the MTT assay, we investigated the effects of UCN on the viability of VSMC and the relative mechanisms. Results：UCN significantly inhibited the viability of VSMC and pre-treatment of the cells with UCN could markedly reduce the effect of Bay K8644, which could increase the viability of VSMC. Conclusion：UCN reduces the viability of adult rat vascular smooth muscle cells via inhibiting L-type calcium channels.Key Words: Urocortin; vascular smooth muscle cells(VSMC); L-type calcium channels ; MTT assayUrocortin（UCN）是机体内分泌的一种40个氨基酸多肽，它属于促肾上腺皮质激素（CRF）类家族，与CRF 在氨基酸序列上有45%的同源性。起初发现于大鼠脑组织中1，然后在人体内也发现其存在2。UCN广泛分布于中枢神经系统、消化系统、心血管系统、生殖系统、免疫和内分泌系统等，是具有生物活性的神经肽，可激活腺苷酸环化酶使细胞内的cAMP聚集3 。它与表达在心脏和血管上的2型CRF受体有高度亲和力1，4，具有心血管保护作用。在血管方面，UCN能引导内皮依赖性和非内皮依赖性血管松驰作用5，6。提示UCN可能直接影响血管平滑肌细胞（VSMC）的功能。近几年关于UCN 与离子通道的关系也成为研究的热点。有研究表明，在大鼠离体基底动脉中，UCN介导的血管松驰作用与K+通道开放有关系7。UCN还能通过激活大鼠肺动脉的钡敏感性的钾通道起到舒张肺动脉的作用8。最近研究报道，UCN能够通过L-型Ca2+通道降低钙内流，起心脏保护作用9。一方面，VSMC在血管重构（VR）中起重要作用10，11。另一方面，血管松驰或重构与Ca2+内流高度相关12，13。众所周知，L-型钙通道是VSMC中主要钙通道类型。Ca2+内流主要通过L-型钙通道。虽然VSMC在血管生理病理中非常重要，然而，关于UCN对VMSC的作用很少知道。本实验室在以往实验中已发现UCN具有抑制血管平滑肌细胞增殖的作用14,但缺乏对其作用与钙离子通道的关系的研究。本实验旨在运用法测定UCN对VSMC活性的影响并对其作用与钙通道的关系进行研究，以进一步阐明UCN对血管重构的作用。一、材料和方法1.动物和药品成年Sprague-Dawley(SD)公鼠，重约200-300g。Urocortin,Astressin,Verapamil,Glybenclamide,Bay K8644分别购自Sigma公司。胰蛋白酶购自AMRESCO公司。小牛血清购自HYCLONE公司。DMEM培养液购自GIBCO公司。2.试剂配制D-HanKs 溶液成份：8g/L NaCl, 0.4g/L KCl, 0.06g/L Na2HPO4, 0.06g/L KH2PO4, 0.35 g/L NaHCO3, pH用NaHCO3溶液调至7.4。PBS溶液组成：8g/L NaCl, 0.2g/L KCl, 2.85g/L Na2HPO4, 0.28g/L KH2PO4。细胞培养液: 13.4g/L DMEM细胞培养基, 3.7g/L NaHCO3, 10%小牛血清(FBS), 100U/ml青霉素, 100ug/ml链霉素, pH用HCl或NaOH调至 7.3。3.VSMC分离、培养采用组织贴块法。于无菌状态下急性取大鼠胸主动脉，浸于PBS液中。谨慎去内皮，将中层平滑肌剪成2mm2大小，内膜面向下等距离粘于培养瓶壁。8小时后加入含10%小牛血清的DMEM，置于潮湿的37孵育箱内（95%空气和5%CO2）培养。应用光镜、免疫组化法鉴定血管平滑肌细胞，用0.1胰蛋白酶消化成细胞悬液，传代、继续培养。第4-5代细胞种于96孔培养板，用于实验。4.MTT法实验VSMC接种在96孔平板上（每孔200l）。沉淀后加入不同浓度的UCN（10-10-10-5M）或者UCN与其它药物，六孔为一组。六个对照组中加入培养液。继续培养48小时。然后每孔加MTT液20l，继续培养4小时。吸出培养液，每孔加入DMSO溶液150l，轻摇十分钟，再在酶标仪上以波长570nm进行比色测定OD值（样本的吸光度）。5.数据分析实验数据以均值标准误(MeanS.E.M)表示。采用One-way ANOVA统计学处理。二、结果1.UCN对VSMC增殖活力的抑制作用如Fig.1所示，UCN显著抑制VSMC的增殖活性，该抑制作用呈浓度依赖性。在10-10、10-9、10-8M时，UCN不能明显影响细胞增殖活力，而当浓度上升至10-7M时，UCN显著抑制VSMC的活力，其吸光度下降率达26.41.4%（N=6，P0.01）。2.Astressin,Glybenclamide,Bay K8644和Verapumil对UCN抑制VSMC活力作用的影响如Fig.2,3,4所示,当VSMC先与CRF受体阻滞剂Astressin（10-6M）作用，加入UCN（10-7M）培养后，吸收率从1.100.01降至0.80 0.02 (n =6, P 0.05)，能抑制VSMC的增殖活力，但与不加Astressin无明显差异。这表示Astressin不能影响UCN对VSMC 的抑制作用。KATP通道阻滞剂，Glybenclamide(10-5M)，单独作用于细胞不能影响VSMC的活力，同样它也不能影响UCN的抑制作用。而特殊的L-型钙通道激动剂，BayK8644(10-6M)，一方面能增加VSMC的活力，而且UCN能显著降低BayK8644对细胞活力的增强作用（n=6,p0.01）。L-型钙通道阻滞剂，Verapamil(2.510-6M)，能降低VSMC的活力，然而，在UCN（10-7M）的作用下，Verapamil不能进一步降低细胞的活性。Fig. 102040608010-10 10-9 10-8 10-7 10-6 10-5UCNMInhibition on the viability of VSMC#* (% of control)Fig.1: Effect of UCN on the viability of VSMC. Values were represented as mean S.E.M. Data were analyzed with t-test .*P0.05, compared to control; #P0.01, compared to control (n=6).Fig. 2 Astressin UCN UCN+Astressin0510152025Inhibition on the viability(% of Control)#*Fig.2: Effects of Astressin(10-5M) on VSMC viability (n=6).#P0.05 vs. UCN(10-7M). Fig.3 Gly UCN UCN+Gly0510152025Inhibition on the viability(% of Control)#*Fig.3: Effects of Gly (10-5M) on VSMC viability in the absence and presence of UCN (10-7M) (n=6). #P0.05 vs. UCN (10-7M).Fig.4 Control UCN Bay BAY+UCN Ver Ver+UCN00.20.40.60.811.21.41.61.8Absorbance(At 570 nm)#*Fig.4: Effects of UCN (10-7M), BayK8644 (10-6M), and verapemil (2.510-6M) on VSMC viability (n=6). #P0.01 vs. control; *P0.01 vs. BayK8644 (10-6M).三、讨论高血压病是目前世界上最常见、发病率最高的疾病，是冠心病和脑血管疾病的主要危险因素。VR的过程包括VSMC的内皮损伤、移行、增生15。特别是增生被认为是VR的重要因素16，17，所以针对VR发生机制以逆转VR是防治高血压及其靶器官损害的关键12。UCN是一种由四十个氨基酸组成的多肽，属于CRF家族，它通过自分泌和旁分泌途径发挥其广泛的生理、药理作用18，19。UCN对心血管系统和其它系统如子宫、淋巴细胞、大脑的作用，已被普遍研究。它与表达在心脏和血管上的2型CRF受体有高度亲和力1，4。有报道，UCN能剂量依赖性地提高心率、心输出量、冠脉血流4，20。在体外试管实验中，UCN在缺氧前和再供氧时均能保护新生大鼠的心脏细胞，同时在离体试验中，UCN能减少缺血/再灌注损伤的成年大鼠的心肌梗死面积21，22。在血管方面，UCN能介导内皮依赖性和非内皮依赖性血管松驰作用，表明UCN与VSMC之间有一定关系。在以往的实验中，我们使用了3H-thymidine 渗入法实验证实了UCN对大鼠VSMC增殖具有抑制作用，但在该实验中没有对其作用机理作充分研究14。本实验运用MTT法进一步观察了UCN对VMSC增殖活力的影响，并对其作用机理进行了探讨。MTT全名四甲基偶氮唑盐。细胞特别是增殖期活细胞可通过线粒体能量代谢中的琥铂酸脱氢酶的作用使淡黄色的MTT分解，形成蓝色结晶物沉淀在细胞中，形成量与细胞增殖状况成正比。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含结晶物的量成正比。再在酶标仪上以波长570nm进行比色测定OD值（样本的吸光度）。有标准曲线显示：细胞数与MTT吸收率呈正相关（R=0.983），因此，MTT法是一种通过测定细胞能量代谢水平来间接反映细胞增殖情况的检测方法，可以用它来测定VSMC的活力15。本实验结果显示：UCN能够浓度依赖性抑制VSMC的增殖活力，这表明UCN可能是VR中有益的血管活性因子。为进一步阐明其作用机理，本实验发现，KATP阻滞剂（GLY）不能影响UCN对VSMC 的抑制作用。CRF阻滞剂（Astressin）也不能影响UCN的抑制作用。Ca2+通道激动剂(Bay K8644)，能够增加VSMC的增殖活力，并且UCN能显著降低Bay K8644 的这一作用。Bay K8644（10-6M），是电压门性钙通道激动剂，能够增强Ca2+内流,从而增加VSMC的增殖活力。细胞被UCN(10-7M)作用后，能减少Bay K8644介导的钙内流,使Bay K8644的作用受抑制。这一现象证明UCN可能通过电压门性钙通道抑制钙离子内流从而抑制细胞的增殖活力。本实验室还用激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)观察到不同浓度UCN(10-7-10-5M)能够减弱Bay K8644介导的细胞内Ca2+荧光密度（数据待发表）。L-型Ca2+通道属电压依赖型钙通道，经L-型Ca2+通道产生的内向钙电流是内钙释放触发的主要机制，所以L-型Ca2+通道的激活对细胞内的钙浓度升高有着极其重要的意义。我们的结果显示UCN通过Ca2+通道对VSMC起抑制作用。本实验结果提供了有力的证据：UCN对VSMC 的增殖抑制作用和L-型钙通道有关。基于VSMC增殖是VR的重要机制15。我们的数据进一步表明，UCN这一内源性多肽可能与VR及其他病理过程如钙超载作用有着密切的关系。 参考文献1Donaldson CJ, Sutton SW, Perrin MH, et al. 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