用Trizol-法提取RNA.docx

此文档收集于网络，仅供学习与交流，如有侵权请联系网站删除用Trizol 法提取RNA什么是Trizol？Trizol 是一种总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出核酸酶。由于RNA酶无处不在和其难以灭活的顽固本性，RNA的抽提环境应严格控制，所用试剂耗材均应是RNase-free或经过DEPC处理过的，具体的注意事项可参见上一篇文章分子狗，你还在谈qRT-PCR色变吗？。接下来我们着重从实验步骤的各个阶段进行剖析：一，样品准备从组织中提取总RNA 液氮研磨，将组织块放入研钵中，加入少量液氮，迅速使用研杵研磨，期间不断加入液氮，直到组织研磨成粉末状。每50-100 mg组织加入1 mlTrizol，转入1.5 ml EP管中进行后续操作。匀浆，组织体积不要超过Trizol体积的10%，用匀浆器充分匀浆，直到无明显颗粒，转入1.5 ml EP管中进行后续操作。从细胞中提取总RNA贴壁细胞，去除培养基，用适量无菌PBS清洗细胞表面，加入1 ml Trizol，用带滤芯的RNase-free枪头反复吹打细胞，将收集的样品置于RNase-free的离心管中，冻存在-80冰箱备用。悬浮细胞，收集细胞悬液，1000g离心5 min，弃培养基；用适量无菌PBS清洗细胞，1000g离心5 min弃上清，沉淀加入1 ml Trizol，用带滤芯的RNase-free枪头反复吹打细胞，将收集的样品置于RNase-free的离心管中，冻存在-80冰箱备用。从细菌中提取总RNA 对于细菌或蛋白质、脂肪、多糖或细胞外基质含量高的样品，需要额外的分离步骤。加入Trizol吹打混匀后，4，12000g，离心10 min。将上清转移至新的RNase-free的离心管中，存在-80冰箱备用。二，RNA提取将冻存的RNA样本从-80冰箱取出置于冰上解冻。于每管样本中加入200 lRNA专用的三氯甲烷(每毫升Trizol加200 l)，置于振荡器震荡1 min，冰上静置5 min。4，12000g，离心10 min。此时液体分三层，将上层的水相转移到另一个RNase-free的离心管中。 加入等体积的-20预冷的RNA专用的异丙醇，上下颠倒混匀，于-20静置15 min以上。注：增加-20的静置时间会增加RNA尤其是miRNA的得率。 4，12000g，离心15 min，小心弃上清。 加入1 ml预冷的75%的乙醇（25% DEPC无菌水，75% RNA专用无水乙醇）涡旋混匀。 4，7500g，离心10 min，尽量去除离心管中的残液，然后在无菌操作台中风干约10 min（注意不要过度干燥，否则难以溶解）。 每个离心管中加入适量的RNase-free的ddH2O溶解沉淀，用枪头吸打混匀，至完全溶解。离心几秒，让离心管中的液体全部在管底，然后置于冰上。 去除杂质DNA：a在RNase-free的离心管中配制以下去除RNA中DNA的体系反应液：ReagentVolumeTotal RNA10 g10DNaseI buffer(Mg2+)5 lDNaseI (1U/l)10 lRNase Inhibitor（40U/l）0.5 lDEPC-treated water up to50 lb加入25 l 50 M的EDTA，65反应10 min。c 用RNase-free的ddH2O定容到100 l。d加入10 l 3M NaAc和250 l冷乙醇，混匀后-80放置30 min以上。e4，12000 rpm离心10 min，弃上清。f加入75%的冷乙醇，4 12000 rpm离心10 min，尽量弃上清。g打开EP管盖子，在操作台中风干约10 min。h 用适量的RNase-free的ddH2O溶解后，使用Nanodrop-2000测RNA的浓度。 琼脂糖电泳检测RNA的完整性：建议使用DEPC处理的ddH2O配置1.2%琼脂糖凝胶，DEPC处理的ddH2O稀释TAE缓冲液。*完整的RNA经凝胶电泳后会明显地观察到28S和18S两条带，并且28S的条带亮度约是18S的两倍。若两条条带不明显，则提示RNA可能部分降解。*提取的RNA可用于后续操作，如需用qRT-PCR检测基因表达，为避免RNA降解，建议提完RNA后立即将RNA逆转录成cDNA进行保存，cDNA可在-20长期保存。 常见问题及解决办法 RNA的各种吸光度代表什么？260 nm、230 nm、280 nm下的吸光度分别代表了核酸、盐浓度和蛋白质等有机物的吸光度值。OD260/OD280（R）体现了RNA中蛋白质等有机物的污染程度，质量较好的RNA的R值应在1.8-2.2之间。当R1.8时，说明溶液中的蛋白质等有机物的污染比较明显；当R2.2时，说明RNA已经被水解成了单核苷酸。RNA提取量低怎么办？加大起始的样本量。向组织或细胞中加入Trizol之后，充分吹吸使样本充分裂解。加入三氯甲烷分层后，尽