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文档简介

RT-PCR全过程步骤一试剂材料准备1、塑料制品：（包括枪头、EP管、匀浆管等）先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中，其中小枪头需要吸管打入DEPC水，过夜，然后高压，再烤干备用，实验前将枪头等放入吸头台，再高压一次（EP管）2、玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净，蒙锡纸烤干备用（DEPC水泡）（洗净后先泡1DEPC过夜，再烤干）3、匀浆器：（包括剪刀、镊子）先洗净后，再高压（不需要泡DEPC）三、试剂配制：1、DEPC水：吸出1ml放在1000ml双蒸水中配成1DEPC水，放在1000ml容量瓶中静置4小时备用。2、75%乙醇：用无水乙醇 DEPC水配，然后放-20保存（其中DEPC水需先高压）3、异丙醇：放入棕色瓶中4、氯仿：放入棕色瓶中5、琼脂糖二总RNA提取1. 取100mg组织，放到1.5mlEP管中，加入1mlTrizol剪碎。(1)液氮研磨，组织块直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按 50-100mg 组织/ml Trizol 加入 Trizol，转入离心管进行第 2 步操作。(2) 匀浆：组织样品按 50-100mg/mlTrizol 加入 Trizol。另外，组织体积不能超过 Trizol 体积的 10%，否则匀浆效果会不好，用电动匀浆器充分匀浆约需 1-2 分钟。2. 震荡30s，室温放置 5min，使其充分裂解。12,000rpm 离心 5min，弃沉淀。3. 加0.2ml氯仿，摇动30s，室温5-10min。注：禁用漩涡振荡器，以免基因组 DNA 断裂。4. 12000g，4离心，15min。5. 吸上层无色水相，移入另一EP管中（约0.5ml）。6. 加等体积异丙醇，室温放置 5-10min。7. 12000g，4离心，10min。在管底部可见微量RNA沉淀8. 弃上清，加冰预冷75%乙醇1ml，温和振荡，悬浮沉淀。9. 8000g，4离心，10min。10. 弃上清，用滤纸小心吸取残留液体，室温干燥5-10min。11. 沉淀溶于20lDEPC水(可用20ul H2O，TE buffer或 0.5%SDS溶解RNA样品，55-60,5-10min。注：H2O、TE或 0.5%SDS均须用DEPC处理并高压。)，取1l加入79lDEPC水测OD260/OD28012. 计算浓度与纯度，-70保存。三、逆转录合成cDNA第一链反应体系如下总体系20l约3gRNA量+1l Oligo dT+water=12l5*RTbuffer 4ldNTP 2lRNase inhibitor 1lAMV Reverse Transpase 1l温度42 1小时冰上配制混匀快速离心一次反应条件如下-20 冰箱冻存四、PCR反应混匀快速离心一次反应条件如下PCR产物-20冰箱保存取PCR产物8l 加5L
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