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1 第五章DNA的损伤 修复和突变 2 第一节DNA的损伤 3 根据受损的部位 DNA损伤可以为两种 碱基损伤DNA链的损伤 DNA损伤 一切使DNA结构和功能发生改变的DNA变化 都可称为基因的损伤 4 DNA存储着生物体赖以生存和繁衍的遗传信息 维护DNA分子的完整性对细胞至关紧要 修复DNA损伤的能力是生物能保持遗传稳定性所在 DNA分子的变化并不是全部都能被修复成原样的 因此生物才会有变异 有进化 DNA损伤修复的重要性 5 细胞内在的因素和环境中的因素都可能导致DNA损伤 根据损伤的原因可以分为 DNA分子自发性损伤物理因素导致的DNA损伤化学因素导致的DNA损伤 6 一 DNA分子自发性损伤 碱基的异构互变2 碱基的脱氨基作用3 脱嘌呤与脱嘧啶 碱基丢失 4 活性氧引起的碱基修饰与链断裂 7 1 碱基的互变异构 DNA每种碱基有几种形式 称互变异构体 异构体中原子的位置及原子之间的键有所不同 碱基各自的异构体间可以自发发生变化 烯醇式与酮基间互变 A CT G上述配对发生在DNA复制时 会造成子代DNA序列与亲代DNA不同的错误损伤 8 同型异构体转换 O OH 9 同型异构体转换 NH2 NH 10 11 异构互变造成的复制损伤 12 2 碱基的脱氨基作用 碱基的环外氨基自发脱落 C变为U A变为次黄嘌呤 I G变为黄嘌呤 X 复制时 U与A配对 H和X都与C配对会导致子代DNA序列的错误变化 13 14 3 脱嘌呤与脱嘧啶 碱基丢失 自发水解使嘌呤和嘧啶从DNA链的核糖磷酸骨架上脱落 哺乳类动物细胞 在30 C下 20h内DNA链自发脱落嘌呤约1000个 嘧啶约500个 15 4 活性氧引起的碱基修饰与链断裂 细胞呼吸的副产物O2 H2O2造成DNA损伤 产生一些碱基修饰物 胸腺嘧啶乙二醇 羟甲基尿嘧啶等 还可引起DNA单链断裂等损伤 这些损失的积累可导致老化 16 17 二 物理因素引起的DNA损伤 紫外线 UV 引起的DNA损伤电辐射引起的DNA损伤 18 1 紫外线 UV 引起的DNA损伤 DNA受到大剂量紫外线 260nm 照射时 同一条链上相邻的嘧啶以共价键连成二聚体 TT CC CT之间都可形成二聚体 复制时 此处产生空耗过程 DNA不能复制 细胞不能分裂 导致凋亡 19 紫外线引起的DNA损伤 最易形成胸腺嘧啶二聚体 TT 20 2 电辐射引起的DNA损伤 碱基变化细胞中的水经辐射解离后产生大量OH 自由基 使DNA链上的碱基氧化修饰 形成过氧化物的 导致碱基环的破坏和脱落等 脱氧核糖变化脱氧核糖上的每个碳原子和羟基上的氢都能与OH 反应 导致脱氧核糖分解 最后会引起DNA链断裂 21 DNA链断裂脱氧核糖破坏或磷酸二酯键断开而导致DNA链断裂 一条链断裂称单链断裂 singlestrandbroken DNA双链在同一处或相近处断裂称为双链断裂 doublestrandbroken 22 交联 binding 同一条DNA链上或两条DNA链上的碱基间以共价键结合 DNA与蛋白质之间也以共价键相连 组蛋白 染色质中的非组蛋白 调控蛋白 与复制和转录有关的酶都会与DNA以共价键连接 胶联是细胞受电离辐射后在显微镜下看到的染色体畸变的分子基础 会影响细胞的功能和DNA复制 23 辐射引起DNA分子结构的多种变化 24 碱基类似物 修饰剂对DNA的损伤 2 烷化剂对DNA的损伤 3 嵌合剂对DNA的损伤 三 化学因素引起的DNA损伤 25 1 碱基类似物对DNA的损伤某些化学物质和正常的碱基在结构上类似 有时会替代正常碱基而掺入DNA分子 一旦这些碱基类似物进人DNA后 由于它们的配对能力不同于正常碱基 便引起DNA复制过程中其对应位置上插入不正确碱基 26 例如5 溴尿嘧啶 BU 和5 溴脱氧尿嘧啶 BrdU 是T结构类似物 细菌在含BU的培养基中培养时 部分DNA中的T被BU取代 BU有两种互变异构体 一种是酮式结构 第6位上有一个酮基 它可以代替T而掺入DNA 并与A配对 当BU发生互变异构成为烯醇式 第6位上是一个羟基 后 就容易和G配对 通常以酮式存在 有时也以烯醇式存在 当BU先以酮式掺入DNA 继而又变成烯醇式时 进一步复制使DNA中A T对变成G C对 同样道理也引起G C向A T的转换 BU可以使细菌的突变率提高近万倍 27 除BU外 还有5 溴脱氧尿苷 5 氟尿嘧啶 5 氯尿嘧啶及它们的脱氧核苷 另一种被广泛应用的碱基类似物是2 氨基嘌呤 2 AP 是一种腺嘌呤A类似物 可和胸腺嘧啶T配对 可再和胞嘧啶C配对 产生A T G C的转换 或2 AP以和胞嘧啶C配对形式进入DNA后再和胸腺嘧啶T配对后产生G C A T的转换 28 2 烷化剂引起的DNA损伤 特异性错配 某些诱变剂不掺入DNA 而通过改变碱基的结构从而引起特异性错配 如烷化剂 是一类亲电子的化合物 具有一个或多个活性烷基 它们的诱变作用是使DNA中的碱基烷化 活性烷基不稳定 能转移到其他分子的电子密度较高的位置上 并置换其中的氢原子 使其成为不稳定的物质 烷化剂的种类很多 常见的有甲磺酸乙酯 EMS 亚硝基胍 NG 和芥子气等 29 EMS能使鸟嘌呤的N位置上有乙基 成为7一乙基鸟嘌呤 与胸腺嘧啶配对 故能使G C转换成A T 烷化剂的另一作用是脱嘌呤 例如烷基在鸟嘌呤N位上活化糖苷键引起断裂 使嘌呤从DNA链上脱掉 产生缺口 复制时 与缺口对应的位点上可能配上任一碱基 从而引起转换或颠换 而且去嘌呤后的DNA容易发生断裂 引起缺失或其他突变 30 3 嵌合剂的致突变作用嵌合染料是另一类重要的DNA修饰剂 包括吖啶橙 acridineorange 原黄素 proflavin 溴化乙锭 EB 等染料 这些试剂为平面分子 其分子大小与碱基对大小差不多 可以嵌入到DNA双链碱基对之间 在嵌入位置上引起单个碱基对的插入或缺失突变 嵌合染料也能嵌入单链DNA的碱基之间 这些突变都会引起阅读框的改变 造成移码突变 31 荧光显微镜下 选用蓝色激发滤片 可见含DNA的细胞核显示黄绿色荧光 含RNA的细胞质及核仁显示橘红色荧光 体外培养的肝癌细胞吖啶橙荧光染色 32 第二节DNA的突变 33 如果DNA的损伤得不到有效的修复 就会造成DNA分子上可遗传的永久性结构变化 称为突变 mutation 少数突变甚至有可能对细胞是有利的 有利突变的累积可以使生物进化 使其能更好地适合于其生存的环境 但绝大部分突变是有害的 对于单细胞生物 不少有害突变是致死的 对于多细胞的高等生物 有害突变会造成病变 如代谢病和肿瘤 34 导致DNA分子结构变化 亦即发生突变 生物体在表型上突变 35 1 突变类型 1 点突变 pointmutation 也称为简单突变或单一位点突变 其最主要的形式为碱基对置换 专指DNA分子单一位点上所发生的碱基对改变 分为转换 transitions 和颠换 transversions 两种形式 36 转换 transition 两种嘧啶碱基 T和G 或两种嘌呤碱基 A和G 之间的相互转变 颠换 transvertion 嘧啶碱基和嘌呤碱基之间的互变 37 点突变带来的后果取决于其发生的位置和具体的突变方式 如果是发生在基因组的垃圾DNA上 就可能不产生任何后果 引物其上的碱基序列缺乏编码和调节基因表达的功能 如果发生在一个基因的启动子或其他调节基因表达的区域 则可能会影响到基因表达的效率 如果发生在一个基因的内部 就有多种可能性 这一方面取决于突变基因的终产物是蛋白质还是RNA 即是蛋白质基因还是RNA基因 另一方面如果是蛋白质基因 还取决于究竟发生在它的编码区 还是非编码区 是内含子 还是外显子 38 发生在蛋白质基因编码区的点突变有三种不同的结果 突变的密码子编码同样的氨基酸 这样的突变对蛋白质的结构和功能不会产生任何影响 因此被称为沉默突变或同义突变 突变的密码子编码不同的氨基酸 导致一种氨基酸残基取代另一种氨基酸残基 这样的突变可能对蛋白质的功能不产生任何影响或影响微乎其微 也可能产生灾难性的影响而带来分子病 突变的密码子变为终止密码子或相反 39 2 移码突变 frame shiftmutation 又称移框突变 是指一个蛋白质基因的编码区发生的一个或多个核苷酸 非3的整数倍 的缺失和插入 由于遗传密码是由3个核苷酸构成的三联体密码 因此 这样的突变将会导致翻译的阅读框架发生改变 致使插入点或缺失点下游的氨基酸序列发生根本性的变化 但也可能会提前引入终止密码子而使多肽链被裁短 移码突变对蛋白质功能的影响取决于插入点或缺失点于起始密码子的距离 40 a 缺失 deletion 插入 insertion DNA链上一个或一段核苷酸的消失或加入 41 移码突变 例如在E coli的lacl基因中发现一种4个碱基序列 CTGG 在野生型中连续重复了3次 J Miller等人研究了这个基因突变热点 hotSpots 产生的原因 发现某些热点是由重复序列引起的 所谓热点即一个基因中比其他位点更容易发生突变的位点 由于插入或缺失突变引起DNA的阅读框 ORF 发生改变 从而产生不同蛋白质的过程 42 b 倒位 inversion 或转位 translocation DNA重组使其中一段核苷酸倒置 或从一处迁移到另一处 c 双链断裂 43 2 突变后果 1 致死性 突变发生在对生命至关重要的基因上 可导致个体或细胞的死亡 44 致死突变 严重影响生物体生活力 导致个体死亡的突变 可分为显性致死突变 杂合态即可致死 和隐性致死突变 纯合态才致死 45 2 基因功能的改变 突变是某些疾病的发病基础 包括遗传病 肿瘤及有遗传倾向的病 有些已知其遗传缺陷所在 但大多数尚在研究中 突变影响生物的代谢过程 导致一个特定生化功能的改变或丧失 46 突变导致生物体外观上可见的形态结构的改变 例如果蝇的红眼 白眼突变 47 例 UVB所致的基因突变UVB 290 320nm 由于修复系统的缺陷或偶发的错误修复 则会导致某些基因突变 使得角质形成细胞的细胞周期的调控出现异常 进一步发生克隆性增生和永生化生长而导致皮肤癌的发生 48 管理基因 caretakergenes 执行DNA的损伤修复 维持基因组的完整性 如着色性干皮病的修复基因XPA XPF 看门基因 gatekeepergenes 控制细胞信号传导 调控细胞的增殖 分化和凋亡 如p53 patched基因和ras等 皮肤癌的发生与看门基因突变关系密切 49 着色性干皮病 xerodermapigmentosis XP 是一种切除修复有缺陷的遗传性疾病 在研究其发病机制时 发现一些相关的基因 称为XPA XPB XPC等 这些基因的表达产物起辨认和切除损伤DNA作用的 XP病人是由于XP基因有缺陷 不能修复紫外线照射引起的DNA损伤 因此易发生皮肤癌 50 p53当UVB损伤DNA造成p53突变后 突变型p53因失去了对细胞周期的正常调控 使得损伤的DNA继续复制 从而提高了染色体畸变的偶发率和遗传的不稳定性 角质形成细胞极易发生克隆增生和恶性转化 51 3 突变导致基因型改变 这种突变只有基因型的改变 而没有可察觉的表型改变 多态性 polymorphism 是用来描述个体之间的基因型差别现象 利用DNA多态性分析技术 可识别个体差异和种 株间差异 控制一些次要性状基因即使发生突变 也不会影响生物的正常生理活动 仍能保持其正常的生活力和繁殖力 为自然选择保留下来 52 对生物个体而言 基因突变的影响不外乎以下四种 产生轻微的 不易被察觉的有害或有利的生物学效应 或者形成生物群体的遗传多态性 产生不利于个体生存或发育 但可遗传的生物学效应 导致遗传学疾病 产生有利于个体生存和发育 且可遗传的生物学效应 促使生物进化 产生致死性突变 导致生物个体在发育过程中死亡 因而不将突变传递给后代 53 突变是进化 分化的分子基础 进化过程是突变的不断发生所造成的 没有突变就没有今天的五彩缤纷的世界 遗传学家认为 没有突变就不会有遗传学 大量的突变都属于由遗传过程自然发生的 叫自发突变或自然突变 spontaneousmutation 54 3 突变的原因 1 自发突变 spontaneousmutations 由内在因素引起的突变称为自发突变 自发点突变自发移码突变 55 由外在因素引发的突变 主要有碱基类似物 烷基化试剂 脱氨基试剂 羟胺等各种诱变剂 每一种诱变剂有其对应的特异性 如对G C A T转换 和对特定的突变位点的偏好 例如 甲磺酸乙酯 EMS 和紫外线 UV 偏好 G C A T转换 黄曲霉素B1 AFB1 则偏好于C G A T颠换 诱变机制 诱变剂通过3种机制诱发突变 取代DNA中的一个碱基 改变一个碱基使之发生错配 破坏一个碱基使之在正常情况下无法配对 2 诱发突变 inducedmutations 56 诱发突变与人类的癌症黄曲霉素 AFB 引起肝癌 紫外线 UV 照射会导致皮肤癌 肿瘤抑制基因是一种编码抑制肿瘤形成的蛋白质基因 如果发生突变则会致癌 对南非和东亚肝癌病人的P53基因的分析发现 AFB特异性诱导G T颠换 引起P53发生突变 而在同一地区的肺癌 肠癌和乳腺癌的病人中未发现此现象 57 黄曲霉素B1 aflatoxinB1 AFB1 一种很强的致癌剂 在鸟嘌呤N 7位置上形成一加成复合物后产生无嘌呤位点 修复要求SOS系统参与 SOS越过无嘌呤位点并在这些位点对应处选择性插入腺嘌呤 使鸟嘌呤残基脱嘌呤的试剂偏向于产生G C T A颠换 58 现代生活环境使人可能接触各种各样药品 化妆品 食物防腐剂 杀虫剂 工业用试剂 污染物等 其中很多化合物已被证明具有致癌性质 研究表明在175种已知的致癌剂中 有157种是诱变剂 这些物质是通过诱导体细胞突变而致癌的 例如食物防腐剂AF 2 食物熏蒸剂二溴乙烯 抗血吸虫药物 多种染发添加剂以及工业化合物氯乙烯等都具致癌性 59 有害物质富集例 DDT在水环境中存在量仅为3 10 6ppm mg L 的时候 当它进入浮游动物体内就被富集为0 04ppm 浮游动物被小鱼吃了 小鱼体内DDT富集量就变为0 5ppm 当小鱼被大鱼吃了 大鱼体内DDT富集量就升高为2ppm 当大鱼被鹰吃了 鹰体内DDT富集量就变为25ppm DDT浓度整整富集了1000万倍 如果人吃了鱼或鹰 那么人体内DDT富集量更是高得可怕 会引起突变 低剂量 长期暴露的蓄积作用 60 61 野生型等位基因 将自然界中普遍出现或指定实验用的某一品系的性状作为 野生型 或 正常 的性状 与这种性状相关的等位基因称为野生型等位基因 突变型等位基因 任何不同于野生型等位基因的相同座位的基因称为突变型等位基因 正向突变 从野生型等位基因变为突变型等位基因 回复突变 从突变型等位基因变为野生型等位基因 62 突变的多方向性和复等位基因一个基因内有很多突变位点 所以 一个基因的突变也有多方向性 从而导致一个基因可以有两个以上的等位形式 复等位基因 63 第三节DNA的修复 64 为了保证遗传信息的高度稳定性 生物细胞在进化过程中形成了一系列多步骤的修复机制 目前对DNA损伤和修复的研究还不多 仅限于辐射 生物反应方面 65 一 错配修复 一旦在DNA复制过程中发生错配 细胞能够通过准确的错配修复系统识别新合成链中的错配并加以校正 DNA子链中的错配几乎完全能被修正 充分反映了母链序列的重要性 因此 错配修复系统对DNA复制忠实性有很大的贡献 66 错配修复可以纠正几乎所有的错配 此外对于对于插入或删除引起的DNA遗传信息的改变也有作用 错配修复是以底物链上的信息为模板进行的 因此这个系统有区分底物链和新合成链的机制 细胞通过识别DNA链的甲基化状态来区分底物链和新合成的链 整个修复过程可以分为识别 切除和修补等步骤 67 Dam甲基化酶使母链位于5 GATC序列中腺甘酸的N6位甲基化 一旦复制叉通过复制起始位点 母链就会再开始DNA合成前的几秒至几分钟内被甲基化 此后 只要两条DNA链上碱基配对出现错误 错配修复系统就会根据 保存母链 修正子链 的原则 找出错误碱基所在的DNA链 并在对应于母链甲基化腺苷酸上游鸟苷酸的5 位置切口子链 再根据错配碱基相对于DNA切口的方位启动修复途径 合成新的子链DNA片段 68 DNA的半甲基化修复机制 错配修复系统 GATCsequencesaretargetsfortheDammethylaseafterreplication Duringtheperiodbeforethismethylationoccurs thenonmethylatedstrandisthetargetforrepairofmismatchedbases 69 1 碱基切除修复 base exciserepair BER 一些碱基在自发或诱变下会发生脱酰胺 然后改变配对性质 造成氨基转换突变 腺嘌呤变为次黄嘌呤与胞嘧啶配对 鸟嘌呤变为黄嘌呤与胞嘧啶配对 胞嘧啶变为尿嘧啶与腺嘌呤配对 二 切除修复 70 BER可以去除因脱氨基或碱基丢失 无氧射线辐射或内源性物质引起的环氮类的甲基化等因素产生的DNA损伤 BER是维持DNA稳定的重要修复方式 其步骤是N 糖苷键水解 从而切除发生变化的碱基 碱基释放过程是由DNA糖苷酶催化的 71 胞嘧啶去氨基生成尿嘧啶 72 如果复制发生就会产生一个突变 73 糖甘水解酶识别改变了的碱基 把碱基从N 糖苷键处切下来 在DNA链上形成去嘌呤或去嘧啶位点 统称为AP位点 74 由AP磷酸内切酶将受损核甘酸的糖甘 磷酸键切开 75 DNA连接酶连接 利用DNA聚合酶I切除损伤部位 补上核苷酸 76 2 核苷酸切除修复 nucleotideexciserepair NER 当DNA链上相应位置的核苷酸发生损伤 导致双链之间无法形成氢键 则由NER负责修复 NER的关键特征是对损伤的DNA链的两端进行切割 NER可以修复UV照射形成的嘧啶二聚体以外 还能消除体内产生的各种嘌呤和嘧啶加合物 NER在已研究过的真核生物中都很相似 说明其在进化过程中高度保守 77 1 通过特异的核酸内切酶识别损伤部位 2 由酶的复合物在损伤的两边切除几个核苷酸 3 DNA聚合酶以母链为模板复制合成新子链 4 DNA连接酶将切口补平 78 识别损伤部位 损伤的两边切除几个核苷酸 核酸外切酶 DNA聚合酶以母链为模板复制合成新子链 DNA连接酶将切口补平 79 切除修复 excisionrepair 切 补 切 封 80 切除修复 excisionrepair 系统在几种酶的协同作用下 先在损伤的任一端打开磷酸二酯键 然后外切掉一段寡核苷酸 留下的缺口由修复性合成来填补 再由连接酶连接 由于这些酶的作用不需可见光激活 也叫暗修复 切除修复不仅能消除由紫外线引起的损伤 也能消除由电离辐射和化学诱变剂引起的其他损伤 切除修复一般发生在下一轮DNA复制之前 又称复制前复制 81 三 直接 回复 修复 直接修复只指不需要移去任何碱基或核苷酸就可以将损伤逆转到正常状态的修复 可分为以下几种 1 光复活酶学光复活过程是修复UV导致的环丁烷嘧啶二聚体的直接机制 这种修复具有高度的专一性 82 光修复 photoreactivation 主要对胸腺嘧啶二聚体而言 修复机制 在可见光 300 600nm 活化之下 由光复活酶 photoreactivatingenzyme PR 催化胸腺嘧啶二聚体分解为单体 参与的酶 光复活酶 PR 83 光复活酶修复 波长400nm可见光激活 84 光复活是针对紫外线引起DNA损伤而形成的胸腺嘧啶二聚体 在损伤部位进行修复的修复途径 光复活作用在可见光的活化下 由光复活酶 PR 又称光解酶催化胸腺嘧啶二聚体分解成为单体 PR酶先与DNA链上的胸腺嘧啶二聚体结合成复合物 复合物以某种方式吸收可见光 并利用光能切断二聚体之间的两个C C键 使胸腺嘧啶二聚体变为两个单体 恢复正常 而后PR酶就从DNA上解离下来 85 过去认为 光复活酶存在于细菌和低等真核生物体内 研究发现在鸟类和有袋类中也有存在 B M Sutherland 1974 报道 在人类白细胞中发现光复活酶 随后发现存在于人类的成纤维细胞和淋巴细胞中 说明这种酶在生物界分布广泛 这一修复机制在哺乳动物中也起重要作用 在E coli中 光复活酶 471aa 是由Phr基因编码 酶在暗处不能起作用 还需要其他的酶来修复UV损伤 在植物和果蝇中也发现能逆转6 4光生成物的光解酶 光复活的修复功能虽然普遍存在 但主要是原核生物中的一种修复方式 86 2 单链断裂修复 DNA单链断裂是损伤的一种常见形式 其中有一部分单链断裂是通过DNA连接酶的简单重接而修复的 DNA连接酶能催化DNA双螺旋结构中的一条链上缺口处的5 磷酸末端与相邻的3 羟基末端形成3 5 磷酸二酯键 连接需要的能量来自NAD E coil 或ATP 动物细胞 DNA连接酶在各类生物的各种细胞中普遍存在 而且修复反应