转基因植物分子检测技术.doc

转基因植物分子检测技术姜桐桐,2，黄凤兰1,2*，陈晓凤1,2，赵永1,2，李佳会1,2，周婷婷1，常旭丰1，刘佳琪1（1.内蒙古民族大学生命科学学院.内蒙古通辽 028000； 2.内蒙古自治区高校蓖麻产业技术研究中心.内蒙古通辽 028000 3内蒙古自治区高校蓖麻育种重点实验室.内蒙古 通辽 028000）摘要：分子生物学和植物基因工程技术不断发展，转基因分子检测技术也得到不断发展，本文介绍了外源基因整合的检测技术和外源基因表达的检测技术，细致的描述了每种检测技术的原理和优缺点。关键词：分子检测技术；转基因植物；原理Transgenic plant molecular detection technologyTongtong jiang1.2 Fenglang Huang1.2 * xiaofeng chen1.2 Yong Zhao1.2 Jiahui Li1.2Tingting Zhou1 Xufeng Chang1 Jiaqi Liu1(1. College of Life Science, Inner Mongolia University for the Nationalities, Tongliao city，028000；2.Inner Mongolia RegionIndustrial Engineering Research Center of Universities for Castor, Tongliao city，028000；3 The Inner Mongolia autonomous region castor breeding, key laboratory of colleges and universities, Tongliao city，028000）Abstract:With the continuous development of molecular biology and plant gene engineering and transgenic molecular detection technology development, this paper introduces the foreign gene integration testing technology and exogenous gene expression detection technology, detailed describes the principle and advantages and disadvantages for each testing technology.Keywords:molecular detection technology; The transgenic plants; The principle of作者简介：姜桐桐（1991年2月），女，在读硕士，E-mail:14794701244163.com 通讯作者：黄凤兰(1973-)，女，山东菏泽，教授，博士，研究方向为蓖麻分子育种。E-mail：.项目基金：内蒙古民族大学研究生科研资助项目（NMDSS1467）、国家自然科学基金项目（30760123； 31160290；31460353）、内蒙古自治区高等学校“青年科技英才支持计划”（NJYT-14-A10）、内蒙古自治区科技创新引导项目、内蒙古自治区“草原英才” 计划项目、市校合作项目（SXZD2012018；SXZD2012017；SXZD2012006） 近年来，转基因植物检测技术日趋成熟，多角度的多方面的检测方向分别从DNA、RNA、蛋白质来对转基因植物进行检测，无论从外源基因整合的方向，还是外源基因表达的方向，都能检测出正确的结果。（一）外源基因整合的检测对转基因的检测和功能鉴定尤为重要。对于转基因检测，我们主要是对是否为转基因、转的什么成分。检测主要针对外源基因整合的检测，常采用PCR检测和Southern杂交。PCR由Mulhs等人于1985年发明1,1988年由于耐热DNA聚合酶的发现,使PCR走向实用阶段,Mulhs因发明PCR获1993年诺贝尔奖。1 PCR检测基本原理:PCR反应的成分是模板DNA(待扩增DNA)、引物、4种脱氧核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和适宜的缓冲液等，过程分为四个连续的反应，其目的是把能够微量的遗传物质在数小时之内扩增达到检测水平，进而完成分析和检测。PCR技术的基本原理是:第一个阶段是在9394 高温条件下将DNA 模板变性，即模板变性解链；第二个阶段是退火2，即我们人工合成的上、下游引物与模板 DNA 链 3端经降温至 55 退火；第三个阶段是延伸，即4种脱氧核苷酸(dNTPs)同时存在的情况下，借助Taq DNA 聚合酶的作用，引物链将沿着 5-3方向延伸与模板互补的新链。此次循环过后，合成新链可将其作为 DNA 模板继续反应，由此循环进行。循环进程中，扩增产物增加，我们所需要的DNA产物可达到l00 万200 万倍3。PCR 反应的原理简单，但是具体的操作是复杂的，各种条件对PCR反应具有很大的影响，如退火温度的确定、延伸时间的长短以及循环数等。因此，不同的反应体系应该确定适当的反应条件，以避免假阴性或假阳性等情况的产生。1.2 优缺点：常规PCR对技术和设备的要求不高，操作简便，成本低，不需要同位素比较，可以保持所检测的目的基因的完整性，它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点,是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。但是，由于常规PCR因为各种条件的差异会出现假阳性或者假阴性，靶序列或扩增序列的交叉污染的现象等，最终出现实验结果的差异，因此，对待常规PCR结果，应作为转基因植物初选的依据。2 Southern杂交 DNA重组技术中Southern印迹杂交是采用特定的方法研究DNA图谱的基本技术,在医学和PCR产物分析等方面有重要价值。2.1 原理 Southern杂交目的是为了检测DNA样品中含有的特定DNA序列。用DNA限制酶将DNA分子状态切割成小分子，利用琼脂糖凝胶电泳分离DNA分子，又称凝胶电泳压印杂交技术,该方法利用硝酸纤维膜或滤纸或尼龙膜等具有吸附DNA的功能,先将DNA片段作凝胶电泳,并将电泳后的DNA区带吸附到膜上,然后直接在膜上进行同位素标记探针与被测DNA之间的杂交,最后通过放射自显影对杂交结果进行检测,以此探测一个DNA样品中含有的特定DNA序列。 Southern杂交是分析基因结构或检测DNA中是否含有特定序列的有效技术之一,根据探针标记的种类不同，可分为同位素标记和非同位素标记两大类3。此种方法是在DNA水平上，对外源基因是否转入并整合到植物染色体的经典方法。因为外源基因在转基因植物基因组中的排布形式和载体骨架的整合方式与外源基因的遗传稳定性和生物安全性密切相关,而Southern杂交能够分析T-DNA和载体骨架的不同区段在转基因生物基因组中的整合与排列方式,以及多拷贝外源基因在转基因生物基因组的整合及遗传行为。Southern 杂交获得的信号强度取决于若干因素，包括固定的 DNA 与探针互补的比例、探针的大小及特异活性以及转移到膜上的基因组 DNA 的数量4。 Southern杂交又被称作为凝胶电泳牙印杂交技术，基本原理是将DNA片段用特定的限制性内切酶处理后进行凝胶电泳，电泳后的DNA区段吸附在膜上，在膜上进行探针与被测DNA之间的杂交，探针的制备可以是纯化的DNA片段或寡核苷酸片段(短寡核苷酸可以用T4多聚核苷酸激酶行末端标记)或放射性同位素标记。放射性同位素标记的探针灵敏度较高, 但存在半衰期限制,对操作者和环境会造成放射性辐射危害。因此，使用非同位素标记探针可避免放射性危害。最后，通过自显影对杂交结果进行检测，由此能够判断出DNA序列。进而探测出一个DNA样品中含有的特定DNA序列。2.2 优缺点:Southern 杂交技术特异性强，灵敏性高，可应用于检测样品中 DNA 及其含量，了解基因的状态，如是否存在点突变、扩增重排等,可清除操作过程中的污染以及假阳性信号，准确度高。缺点是杂交程序复杂，成本高，对实验技术条件要求较高，试剂盒在6000元以上。（二）外源基因表达的检测 这种检测分为两大类，一类数用探针检测mRNA;第二类是用抗体检测出表达的蛋白质(转录水平上对特异mRNA的检测和翻译水平上对特异蛋白质的检测）1 Northern印迹杂交 1.1 原理：1977 年，Alwine 5等首次运用印迹技术检测 RNA，这种与 DNA 印迹技术相对应的 RNA 印迹技术被称为 Northern 印迹杂( Northernblot) 。Northern 杂交只需要利用一段单链 cDNA 分子探针便可以检测和测量不同长度的 RNA 分子，所以很快就得到了广泛运用6。RNA印迹杂交正好与DNA相对应，是将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法，此检测方法，进样前用的是甲基氢氧化银、乙二醛或甲醛使RNA变性，而不是用NaOH，因为会水解RNA的2-羟基基团，变性后的RNA进行琼脂糖凝胶电泳分离，胶中不能添加EB，会影响RNA与硝酸纤维素膜的结合吸印转移到尼龙膜上，转印后用低盐缓冲液洗脱,否则RNA会被洗脱，然后进行杂交。若需要测定片段的大小，可在同一块胶上加分子量标记物一同电泳，之后将标记物切下、上色、照相,样品胶则进行Northern转印。最后结果的判定，可以是按Sambrook等7的方法进行预杂交、杂交、洗膜及放射自显影,放射自显影底片通过计算机图像分析仪扫描得到结果。1.2 优缺点：Northern杂交灵敏度极高，更接近性状表现，更有现实意义，应用广泛。但是对RNA提取条件严格，在材料内含量不如DNA高，不适合于大批量样品的检测，并且其所需药品具有毒害作用，对研究人员有很大伤害。 2 荧光定量PCR技术2.1 原理 实时荧光定量PCR技术是DNA定量技术的一次飞跃。运用该技术，可以对DNA、RNA样品进行定量和定性分析8。荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法9。荧光定量PCR实现了PCR反应从定性到定量的过程，是在常规PCR反应体系中添加荧光基团，荧光基团中受体发色团之间偶极相互作用，能量从供体发色团转移到受体发色团，通过荧光定量的传递，检测荧光信号就可以得靶序列初始浓度，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析，从而达到定量分析的目的。 2.2 优缺点:荧光定量PCR的定量分析，使样品初始模板浓度实现了定量分析，灵敏的荧光检测系统可以对荧光信号进行实时监控，使PCR反应能够进行调节和控制，特异性好，引物或和探针的特异性杂交对模板进行鉴别，具有很高的准确性，假阳性低;灵敏度高，误差小;操作简单，自动化程度高，整个扩增和检测都是在闭管的情况下进行，不需要开盖，交叉污染和污染环境机会少。3 Western杂交3.1 原理:Western杂交(westernblotting)是一种检测固定在基质上的蛋白质的免疫化学方法,也称为蛋白印迹或免疫印迹(Immuno一blotting)。它根据蛋白质分子量进行电泳分离,可以有效地用来鉴定某一蛋白质的性质、定量分析小分子抗原、筛选及纯化抗体、分析蛋白质的结构域、检测(转)基因表达结果等10。这种检测是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的蛋白质检测技术。基本原理是将检测的蛋白质经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，再把目的蛋白原位固定在固相膜上，同时将膜放入高浓度的蛋白质溶液中温育，封闭非特异性位点，再转移到滤膜上，最后在印迹上用特定抗体(一抗)与目的蛋白(抗原)杂交，再加入能与一抗专一结合的标记二抗，最后通过二抗上的标记化合物的性质进行检出。最后我们可以根据检测的结果，推断出蛋白是否表达，浓度以及大致的分子量。3.2 优缺点：通常的检测是在基因水平上，而此检测方法是在翻译水平上检测目的基因的表达结果，能够直接表达出目的基因的导入对所转植物的影响，这就在一定程度上反映了转基因的成败，所以具有非常重要的意义。但是，此类方法的缺点是操作烦琐，费用较高，不适合实际应用和批量检测。（三）展望转基因植物越来越多的进入我们生活。因而转基因植物对环境和人类健康的安全性也随之受到关注。随着时代与科技的进步，其发展前景是广阔的，进而转基因植物的检测技术也会相应的发展，虽然目前，转基因植物的检测技术各有其优点，针对某一种的检测样品有相对应的检测技术，但是，每一种检测技术也都有其不可避免的缺点，这就需要我们在实验中探索与前进，才能使转基因检测技术完善，标准化、高灵敏度、高通量、自动化、低成本。参考文献1MullisKB.Theunusualoriginofthepolymearseehainerae-tion.SeientifieAmeriean,1990,4:562 谢海燕.黑线仓鼠 LHR 部分序列克隆及组织器官的表达差异 D.曲阜：曲阜师范大学，2011.1 常世敏.PCR 在食品微生物检测中的应用J.邯郸农业高等专科学校学报，2004，21（4）：23-25.1姜永均. Southern印迹杂交及其他相关印迹技术简介J. 生物学教学,2010,11:64-65.1郑景生,吕蓓.分子植物育种,2003年,第1卷,第3期,第381 394页 Molecular Plant Breeding,2003,Vol.1,No.3,381 3942 CHANDLER D, WAGNON C, BOLTONH J. Reverse transcriptase(RT) inhibition ofPCR at low concentrations of templateand its implications for quantitative RT-PCR J. ApplEnvironMicrobio,1998, 64(2): 6693Hltke HJ, Ankenbauer W, Mhlegger K, et al. The digoxigenin（DIG）system for non-radioactive labelling and detection of nucleic acidsJ. Cellular and Molecular Biology（Noisy-le-Grand, France）, 1995, 41（7）：883-905. 4 萨姆布鲁克 J, 拉塞尔 D W.分子克隆实验指南M. 3 版, 黄培堂译.北京:北方科学出版社,2002: 492-509.5 Alwine J C，Ke