急超容血液稀释对缺血再灌注损伤心肌细胞凋亡的影响.doc

急性超容性血液稀释对缺血/再灌注损伤在体兔心肌细胞凋亡的影响程明华 方雄水 林拥华 杨普春（汕头大学医学院第一附属医院，广东 汕头 515041）【摘要】 目的：探讨急性超容性血液稀释（AHH）对缺血/再灌注（I/R）损伤在体兔心肌细胞凋亡的影响。方法：36只兔随机分为三组，每组12只，I组为对照组；II组为急性等容性血液稀释组（ANH）；III组为AHH。观察心肌缺血45min及再灌注180min时SOD、MDA含量变化、心肌超微结构改变、心肌细胞凋亡和Bcl-2及Bax表达。结果：与I组比较，II、III组再灌后SOD活性增加，凋亡指数和Bax含量减少，Bcl-2含量增加(p0.05）。心肌细胞超微结构表现为损伤减轻。II、III组间比较，各参数无明显差异。结论：AHH能通过抗氧化作用和调节Bcl-2及Bax表达来减轻I/R损伤后的心肌细胞凋亡。关键词 急性超容性血液稀释；I/R；心肌凋亡；兔Effcts of acute hypervolemic hemodilution on cardiomyocyte apoptosis during ischemic /reperfusion injury in rabbits CHENG Ming-hua, FANG Xiong-shui，LIN Yong-hua, et al. First Affiliated Hospital of Medical College of Shantou University, Shantou 515041, Guangdong,China 【Abstract】 Objective To observe the effcts of acute hypervolemic hemodilution (AHH) on cardiomyocyte apoptosis during ischemic /reperfusion(I/R) injury in rabbits. Methods 36 rabbits were randomly divided into 3 groups with 12 in each one : group (control) , group II( acute normovolemic hemodilution ,ANH) and group (AHH). The activities of SOD, the content of MDA and the expressions of Fas,Bcl-2 protein in myocardium were measured , the ultrastructure were observed after 45 min of ischemia and 180 min of reperfusion.Apoptosis was identified by TUNEL and apoptosis index(AI) was obtained. Results Compared with the group , group II and III rabbits showed protection against I/R injury as evidenced by marked decrease of AI and the content of Fas protein, significantly increased the content of Bci-2 protein and activity of SOD(p0.05）.The ultrastructure of myocardium showed attenuated injury. Conclusion AHH can reduce rabbit myocardial apoptosis induced by I/R injury through regulating the expressions of Bcl-2 and Bax gene. 【Key Words】 Acute hypervolemic hemodilution；Ischemia and reperfusion；Myocardial apoptosis； Rabbits急性超容性血液稀释（acute hypervolemic hemodilution,AHH）是在快速输注一定量的胶体或晶体溶液而不采集自体血，保证了足够的血容量储备，减少了术中血液有形成分的丢失，从而减少异体血需求量（1）。凋亡是心肌缺血/再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury,I/R）的病理特征之一，对心肌I/R及其转归具有重要意义。因此，减少心肌细胞凋亡是心肌保护的重要途径。本课题以I/R在体兔模型复制病变心肌，以心肌凋亡细胞为主要检测指标，旨在探讨AHH对I/R心肌细胞的影响，以便为AHH安全应用提供依据。1 材料与方法1材料1研究对象：健康新西兰白兔36只，雌雄不拘（由南方医科大学动物中心提供）。2药物及试剂：6羟乙基淀粉（HES,北京费森尤司公司）；原位细胞凋亡试剂盒（德国Boehringer Mannheim产品）；Bax和Bcl-2单克隆抗体免疫组化试剂盒（武汉博士德公司）；超氧化物歧化酶（SOD）及丙二醛（MDA）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）。2方法：1 I/R损伤模型制备：全身麻醉。气管切开插管机械通气。颈内静脉置管，持续滴注平衡液10ml/kg.h-1。股动脉置管连接换能器测压。开胸切开心包，缝线绕过左冠状动脉前降支（LAD）近端深面并用硅胶管将其套住。拉紧套管即阻断相应冠状动脉，表现为心肌局部青紫，心电图ST段上抬，表明心肌缺血。放松套管，局部反应性充血，表明心肌再灌注。2 血液稀释处理：实验动物建立I/R模型后随机均分为三组，每组12只。A组为非血液稀释对照组，行I/R但不行血液稀释；B组为急性等容性血液稀释（ANH）组，约10min内股动脉放血20 ml/kg，同时经颈内静脉输入等量6%HES；C组为AHH实验组，约10min内经颈内静脉输入6%HES20ml/kg。血液稀释完成且血压稳定20min后，三组动物均LAD阻断45min，再灌注120min。3 血液学指标检测：分别于缺血前、缺血45min、再灌注120min时心腔内采血，按试剂盒说明书测定MDA含量、SOD活性。4 心肌超微结构观察：再灌注后LAD重新结扎，注射0.5%伊文思蓝1.5ml，缺血区清楚显示后迅速取出心脏。取心尖以上缺血梗死区横切2mm厚心肌组织块置于3%戊二醛固定24h（4），再以1%锇酸固定1.5h，脱水、包埋以制备透射电镜切片，在透射电镜下观察心肌细胞超微结构。5 凋亡指数、Bcl-2 、Bax检测取出心脏后,分离出左心室缺血区，放置于液氮中保存。心肌标本做成石蜡切片,采用末端标记技术(TUNEL)检测细胞凋亡,按试剂盒说明操作,DAB显色,苏木素复染。凋亡细胞核呈棕色,其它细胞核呈蓝色。每只兔观察5张切片,每张切片计数5个高倍视野(400)中凋亡阳性细胞核数目占总细胞核数目的比例,即凋亡指数(AI)。采用免疫组化(SABC)检测Bcl-2和Fas,DAB显色,苏木素复染,阳性物质位于细胞浆,为棕黄色,细胞核呈蓝色。每只兔取5张切片,每张切片取5个高倍视野(400),采用HMIAS - 2000 高清晰度医学图文分析系统,测定平均灰度值。3统计学处理 计量资料用s表示，用F检验进行统计学处理，两组间比较采用Student，t检验2 结果1一般情况 每组12只兔均完成实验。平均体重、性别、输液量、稀释前Hct组间无显著差异(p0.05)。ANH组Hct由稀释前0.430.03降至稀释后0.320.06, ANH组Hct由0.420.02降至0.310.04,组实验前后分别为0.420.04、0.420.03。2 血浆MDA、SOD变化 缺血后，对照组血浆SOD活性明显降低（p0.05），AHH、ANH组血浆SOD活性亦降低，但差异无显著性。再灌注后，对照组血浆SOD活性进一步降低（p0.05）。AHH、ANH组血浆活性有不同程度的回升，与对照组差异有显著性（p0.05）。对照组MDA含量在缺血后及再灌注后升高（p0.05），AHH、ANH组MDA含量升高较对照轻（表1）。表1.AHH对血浆SOD活性MDA含量的影响（n=12，s）SOD(nu/ml)MDA(nmol/ml)缺血前缺血45min再灌注180min缺血前缺血45min再灌注180min对照组419.8432.26368.6630.24360.2228.482.750.42.940.263.940.40ANH组418.3840.34386.7836.67407.4538.27*2.760.52.890.343.340.38AHH组420.8632.45392.6428.64428.9435.82*2.690.33.040.243.080.25*与缺血前比较，p0.05 与缺血45min比较，p0.05，与同时点对照组比较，* p0.053 心肌细胞超微结构改变 对照组心肌细胞结构破坏严重,肌膜肿胀破损,肌膜下积液,肌原纤维结构模糊,可见大片碎裂、溶解区及异常收缩带,线粒体破裂、溶解或明显肿胀,其内结构模糊不清,细胞核轻度肿胀,核周大量积液，微血管内皮轻度肿胀。AHH组与ANH组的心肌细胞损伤程度相似,均轻于对照组,肌膜基本完整,少部分区域有肌撕裂,线粒体肿胀,基质变淡,嵴平行排列,间隙增宽，细胞核及微血管结构基本正常。4 凋亡指数和Bcl-2 及Bax表达 TUNEL标记凋亡细胞阳性的细胞核呈棕褐色着染，细胞核呈碎点状，不规则，大小不一。与对照相比，AHH、ANH组 AI、Bcl-2和Bax灰度值均有显著差异（p0.01或0.05），与ANH组比较，AHH组AI值明显降低、Bax灰度值明显升高（0.05）(表2)。表2 AHH对I/R损伤心肌AI及Bcl-2 、Bax表达的影响（n=12,s）AIBcl-2灰度值Bax灰度值对照组38.266.42160.549.8289.627.46ANH组18.683.25*134.357.63*138.435.67*AHH组9.642.37*129.948.61*154.364.23*与对照组相比，* p0.05, * p0.01；与ANH组相比，p0.053 讨论 长时间心肌缺血可引起组织损伤和细胞死亡，早期恢复其血流灌注是组织细胞存活的必要措施之一。但I/R后,心肌组织中往往发生钙超载、免疫反应、中性粒细胞聚集以及自由基产生等现象，可导致心肌I/R损伤(2)。I/R后产生的大量氧自由基及通过与不饱和脂肪酸作用引发脂质过氧化反应生成的MDA，可通过多种途径造成细胞膜及亚细胞器膜结构破坏，导致再灌注损伤。SOD是内源性氧自由基清除剂，而MDA是脂质过氧化反应的终产物，两者是能反映氧自由基的产生及引发脂质过氧化反应程度的指标，心肌细胞超微结构的改变则是反映细胞损伤最直观的指标(3)。本实验观察到缺血后,尤以再灌后,组血浆SOD活性明显降低,MDA含量升高,心肌细胞超微结构破坏严重,于再灌前行血液稀释,则使血浆SOD活性升高,心肌细胞超微结构损伤明显减轻,表明血液稀释可以保护SOD活性,减轻自由基介导的脂质过氧化反应,对抗再灌注所致的心肌损伤,这可能是由于血液稀释改善血液流变学，增加缺血区心肌的血流量和供氧量，同时可通过外周血管阻力，降低心肌耗氧量；血流量增加还有利于冲走蓄积在心肌组织内的自由基、白细胞、儿茶酚胺、丙二醛及其它有害代谢产物，减少自由基的产生，减轻自由基介导的脂质过氧化反应，保护线粒体、膜磷脂、蛋白、核酸等细胞成分(5)。 本研究显示心肌I/R后,可以出现心肌细胞凋亡,而血液稀释可以明显抑制细胞凋亡。I/R导致细胞凋亡的机制目前还不清楚,可能是肿瘤坏死因子( TNF) 激活死亡受体( Fas 等) ,并通过一系列的信号转导途径最终导致细胞自身程序性死亡(4)。本研究还显示血液稀释可以明显提高Bcl-2蛋白的表达,而抑制Bax蛋白的表达。因此血液稀释预处理具有抗心肌细胞凋亡的作用,而且此作用可能与促进Bcl-2 表达和抑制Bax 表达相关。对Bcl-2 的研究证实其在凋亡的调控中起到保护作用,Bcl-2 基因是抗凋亡的核心分子,可抑制包括Caspase 等许多刺激诱发的凋亡。Bax 也属于Bcl-2 家族, 但其作用是促进凋亡。Bcl-2 可以和Bax 结合成异源二聚体从而抑制凋亡的发生(6)。 本研究还显示，与ANH组比较，AHH组凋亡指数明显降低、Bax表达明显升高，但两组Bcl-2表达、血浆MDA、SOD变化及心肌细胞超微结构改变均无明显差异，因此，AHH的抗心肌细胞凋亡作用是否优于ANH还有待进一步研究确认。4 参考文献 程明华,李流,方雄水,等.急性超容性血液稀释与控制性降压联合应用的可行性研究.中国现代医学杂志,2003;13(8):70-73 Galang N, Sasaki H, Maulik N. Apoptotic cell death during ischemia/reperfusion and its attenuation by antioxidant therapy.Toxicology,2000,148(2-3):111-118. Chen QM, Tu VC, Wu Y, et al. Hydrogen peroxide dose dependent induction of cell death or hypertrophy in cardiomyocytes.