稳定表达人骨形态发生蛋白2基因骨组织工程种子细胞的构建.doc

www.CRTER.org俞莉敏，等. 稳定表达人骨形态发生蛋白2基因骨组织工程种子细胞的构建稳定表达人骨形态发生蛋白2基因骨组织工程种子细胞的构建俞莉敏1，马俊轩2，李继云1，于滨生1(1北京大学深圳医院脊柱外科，广东省深圳市 518036；2深圳市脊柱外科重点实验室，广东省深圳市 518036)引用本文：俞莉敏，马俊轩，李继云，于滨生. 稳定表达人骨形态发生蛋白2基因骨组织工程种子细胞的构建J.中国组织工程研究，2017，21(17):2722-2728.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.17.016 ORCID: 0000-0002-6486-8656(俞莉敏)文章快速阅读：构建稳定表达人骨形态发生蛋白2基因的骨组织工程种子细胞观察指标：转染后细胞的生长增殖生物学性状；在培养48 h和3周后，行人骨形态发生蛋白2 mRNA基因表达的RT-PCR测定，人骨形态发生蛋白2蛋白表达和分泌的免疫组织化学和免疫酶斑点测定，以及转染1周后细胞成骨潜能碱性磷酸酶比活性的检测。干预：利用脂质体介导转染人骨形态发生蛋白2修饰人骨髓间充质干细胞，置于G418培养液中筛选培养结果表明：人骨形态发生蛋白2基因转染修饰的人骨髓间充质干细胞生长增殖分化等生物学活性良好，可稳定表达分泌外源转染基因人骨形态发生蛋白2。文题释义：基因转染间充质干细胞：通过将成骨基因导入细胞，不同于重组细胞因子的爆发性释放，可实现高活性成骨蛋白的持久稳定表达及生理性释放。其中骨髓来源间充质干细胞在成骨诱导下可分化为成骨细胞，介导骨组织的再生，将骨形态蛋白基因导入间充质干细胞，不仅可实现骨形态蛋白的持续性缓释，也提供了骨组织修复所需要的有成骨分化潜能的干细胞，采用这类稳定表达骨形态蛋白基因的干细胞促进骨组织修复，已在动物实验得到了证实。稳定表达人骨形态发生蛋白2基因的骨组织工程种子细胞构建：实验采用微创取出的微量人肌肉组织扩增人骨形态发生蛋白2基因，构建含抗性筛选基因的真核表达载体，以利于筛选种子细胞，并且通过使用相对病毒载体具有更低免疫原性和风险性的质粒载体，转染由人骨髓分离培养来源间充质干细胞。同源基因在同源细胞内表达同源蛋白不具有免疫原性，使基因治疗结合组织工程能构建可稳定表达分泌人骨形态发生蛋白2的种子细胞，这种方法更为安全、更接近于临床转化应用。摘要背景：由于人与动物之间蛋白基因的非完全同源性，人源基因构建组织工程人工骨促进动物成骨或脊柱融合影响了实验验证效果。俞莉敏，男，1976年生，江西省玉山县人，汉族，北京大学医学部博士后出站，博士，副主任医师，主要从事脊柱外科临床与基因组织工程研究。 通讯作者：俞莉敏，北京大学深圳医院脊柱外科，广东省深圳市 518036中图分类号:R394.2文献标识码:B文章编号:2095-4344(2017)17-02722-07稿件接受：2017-01-12Yu Li-min, M.D., Associate chief physician, Department of Spine Surgery, Peking University Shenzhen Hospital, Shenzhen 518036, Guangdong Province, ChinaCorresponding author: Yu Li-min, Department of Spine Surgery, Peking University Shenzhen Hospital, Shenzhen 518036, Guangdong Province, China目的：构建可稳定表达分泌人骨形态发生蛋白2的组织工程种子细胞系。方法：以巢式RT-PCR方法从人肌肉组织中克隆人骨形态发生蛋白2基因全长基因，纯化后连接构建pcDNA3-hBMP2真核表达载体系统，实验组利用脂质体介导转染修饰人骨髓间充质干细胞，置于G418培养液中筛选培养，设定空载质粒转染细胞(阳性对照组)及正常培养细胞(空白对照组)作为对照，观察检测转染后细胞的生长增殖生物学性状；在培养48 h和3周后，行人骨形态发生蛋白2 mRNA基因表达的RT-PCR测定，人骨形态发生蛋白2蛋白表达和分泌的免疫组织化学和免疫酶斑点测定，以及转染1周后细胞成骨潜能碱性磷酸酶比活性的检测。结果与结论：转染人骨形态发生蛋白2基因的人骨髓间充质干细胞成簇样生长聚集，传代培养生长增殖良好，G418 筛选培养可得到抗性细胞克隆，有类似钙结节样形成，细胞增殖与两对照组无差异；RT-PCR、免疫酶斑点及免疫组织化学检测结果检测，实验组转染48 h和3周时均能转录和表达人骨形态发生蛋白2，转染48 h的表达较3周时要高，两对照组未见有明显蛋白转录表达；正常培养或G418筛选培养时，实验组碱性磷酸酶比活性显著高于阳性对照组、空白对照组(P 0.01)；结果表明，人骨形态发生蛋白2基因转染修饰的人骨髓间充质干细胞生长增殖分化等生物学活性良好，可稳定表达分泌外源转染基因人骨形态发生蛋白2。关键词：干细胞；分化；骨髓间充质干细胞；骨形态发生蛋白2；骨组织工程；基因治疗；质粒转染；成骨分化主题词：干细胞；骨形态发生蛋白质类；基因疗法；组织工程基金资助：广东省医学科研基金(A2014654)；深圳市科技创新委员会基金(JCYJ20150403091443319)3 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 Construction of seed cells with the stable expression of human bone morphogenetic protein 2 gene for bone tissue engineering Yu Li-min1, Ma Jun-xuan2, Li Ji-yun1, Yu Bin-sheng1 (1Department of Spine Surgery, Peking University Shenzhen Hospital, Shenzhen 518036, Guangdong Province, China; 2Shenzhen Key Laboratory of Spine Surgery, Shenzhen 518036, Guangdong Province, China)AbstractBACKGROUND: Because of the non-homology of protein and gene between human and animals, to promote osteogenesis or spinal fusion of animals by construction of tissue-engineered bone with the human gene has influenced the experimental validation.OBJECTIVE: To construct the seed cell line for bone tissue engineering with stable expression of human bone morphogenetic protein 2 (hBMP2). METHODS: The full-length hBMP2 gene was cloned from human muscle tissues by nested RT-PCR and transfected to human bone marrow mesenchymal stem cells (hBMSCs) with lipidosome. The transfected hBMSCs were cultured with G418 in vitro to screen and purify the cells. A series of analyses such as RT-PCR, dot-ELISA, immunohistochemstry and alkaline phosphatase activity analysis were performed to evaluate the situation of hBMP2 expression and secretion at 48 hours and 3 weeks after the transduction. hBMSCs transduced with empty plasmid and the normal hBMSCs served as positive control and blank control groups, respectively, which were used for observation of cell growth, proliferation and biological characteristics of transfected cells. RESULTS AND CONCLUSION: The transfected hBMSCs appeared in small groups or clusters, and had a good proliferation after subculture in vitro. Some G418-resistance cell clones and calcium nodules were found when cultured with G418 in vitro. No significant difference was noted in the cell proliferation between the hBMP2 transfection group and two control groups. The ALP activity in the hBMP2 transfection group remained significantly higher than that in the two control groups (P 0.05)，细胞生长曲线在第1天稍减，随后增殖至第4天高峰，又逐渐趋向平稳。而转染后G418筛选组A值则一直下跌，第4天达到低谷后逐渐少量增殖上升，维持稳定增殖，见图4。2.5 各组RT-PCR及dot-ELISA检测结果 从RT-PCR检测结果分析，48 h和3周的实验组均能转录和表达人骨形态发生蛋白2，即在约1 188 bp位置上出现了明显条带，相对3周时的电泳条带，48 h的条带稍微较其更亮，检测系统的灰度统计也说明了转染后人骨形态发生蛋白2瞬时的RNA转录及表达较3周时表达量要高；而空白对照组及阳性对照组未见有明显蛋白转录(图5)。 转染细胞分泌人骨形态发生蛋白2蛋白的dot-ELISA测定，48 h后转染实验组相对于阳性对照组及空白对照组为免疫阳性结果，而3周后转染实验组仍维持阳性结果，但免疫显色较48 h后的结果为淡。免疫组织化学染色显示，实验组人骨形态发生蛋白2转染细胞筛选培养后成簇样生长并形成类似钙结节，经培养48 h和3周后，细胞质内均出现强阳性表达棕色颗粒样结果(图6)，空白对照组及阳性对照组均未见阳性表达。2.6 各组细胞碱性磷酸酶比活性比较 正常培养1周时，实验组、阳性对照组及空白对照组细胞的碱性磷酸酶比活性分别为(0.430.02)，(0.220.02)，(0.240.01) U/mg，实验组明显高于其余两组(P 0.01)；经G418筛选培养1周时，除空白对照组细胞被全部杀死外，实验组碱性磷酸酶比活性为(0.770.03) U/mg，明显高于阳性对照组的(0.250.01) U/mg，(P 0.01)。3 讨论 Discussion骨的修复和融合过程是一个复杂而高度有序的过程，这期间需要能分化的骨前体细胞和足量的成骨诱导因子2个基本要素的系统性参与和协调作用，最终在待修复局部形成新骨融合。目前国内外临床为促进骨修复和脊柱融合，应用较多的是自体骨、同种异体骨和异种骨移植及原核表达重组成骨蛋白。然而自体骨的有限性、供骨区并发症，异体和异种骨的免疫原性，都在临床应用上产生了较大限制。成骨蛋白的原核和真核表达都已得到认同，但其各自在活性及产量上的缺陷，在外源给药方法、持续时间及药效浓度维持等方面的不确定性，加上重组蛋白的异化致炎性和释放不可控性，都是临床应用所必需面对的难题22。而基因治疗通过将成骨基因导入细胞，不同于重组细胞因子的爆发性释放，可实现高活性成骨蛋白的持久表达及释放。目前国内外学者研究多集中在人或动物成骨基因修饰的动物(如鼠、兔子、猴子等)细胞，构建组织工程人工骨促进动物成骨或脊柱融合的实验研究，但由于人与动物之间蛋白基因的非完全同源性，影响了实验验证效果。基因组织工程骨进行下一步临床试用的前提，必须是由人类基因修饰表达的人类细胞构建成的组织工程人工骨，才能应用于临床人类自身。实验以骨科及脊柱外科临床应用为目标，采用扩增于人肌肉组织的人骨形态发生蛋白2基因，通过质粒真核表达载体转染人骨髓间充质干细胞，构建一种可生理性分泌人骨形态发生蛋白2的可分化间充质干细胞作为组织工程种子细胞系，该细胞本身可在自身分泌的人骨形态发生蛋白2诱导作用下进一步分化成成骨细胞，并且还能通过分泌到胞外的人骨形态发生蛋白2，诱导周边未转染间充质细胞向成骨分化。实验中的免疫组织化学染色结果和RT-PCR检测结果，均显示了培养48 h和3周的转染细胞胞浆内均有人骨形态发生蛋白2蛋白表达，阳性对照组及空白对照组细胞未见人骨形态发生蛋白2表达。而dot-ELISA实验是一种能对细胞分泌于膜外、培养上清内的蛋白进行检测的常用方法，其灵敏度可达ng水平。实验从转染细胞的培养上清中检测出了人骨形态发生蛋白2蛋白的表达，而阳性对照组及空白对照组细胞显示了阴性结果，这充分证明了转染后的细胞能表达且分泌人骨形态发生蛋白2蛋白。由真核细胞直接分泌人骨形态发生蛋白2，无需提纯和复性等工序，具有相对重组人骨形态发生蛋白2更高的活性，与此同时人骨形态发生蛋白2可由细胞持续分泌，其作用剂量更接近生理调控剂量，相对于重组人骨形态发生蛋白2应用时的爆发性释放具有更高的安全 性23，能避免重组生产和外源应用蛋白的诸多不利因素。实验构建的基因修饰骨种子细胞能实现成骨因子缓释的同时，提供足量可诱导成骨分化的骨前体细胞，满足骨再生修复的基本要素，能较完美解决以上困扰和不足，利于基础实验成果向临床应用转化，促进骨再生修复。基于人骨形态发生蛋白2的基因治疗用于骨缺损的修复已得到大量实验验证，然而基因治疗的临床转化仍面临较大挑战，其中首要问题就是安全问题，包括病毒基因载体的免疫反应、病毒感染、转染外源性基因细胞的排斥以及外源性基因的表达失控等24。研究采用脂质体介导质粒转染人骨髓间充质干细胞，脂质体是应用简便、细胞毒性低的转染介质，其内脂双分子层组成的环状封闭囊泡可以和DNA形成脂类-DNA的复合物，通过胞饮内吞的方式进入细胞，从而使外源基因插入真核细胞基因组而获得表达25。脂质体介导的基因转染中，外源基因并不与宿主细胞的基因组染色体相整合，存在随着时间的推移外源基因丢失的情况26，在表达分泌了成骨因子后，相对病毒载体，避免了体内基因失控性和无限期表达具有更多的风险及并发症，因此脂质体质粒作为基因治疗载体具有更为明显的安全性和优越性20，27。虽然转染效率稍低，但通过RT-PCR分析、dot-ELISA实验及免疫组化染色等证实：在48 h和3周后转染人骨形态发生蛋白2细胞能瞬时(48 h)及稳定(3周)地转录表达并且分泌人骨形态发生蛋白2基因蛋白。而两对照组的3种实验均为阴性结果，3周时，临床骨愈合过程正处于血肿机化炎症期向骨痂形成期发展，正是最需要成骨因子和骨前体细胞向成骨细胞和成软骨细胞转化时，仍能稳定表达成骨基因，也就能有效促进骨再生。基因治疗的关键步骤就是目的基因片段的设计扩增、验证、纯化和基因真核表达系统的构建，这些步骤决定了目的基因修饰的种子细胞能否成功构建和纯化。真核蛋白在真核细胞中的表达一般均以其蛋白基因编码的特性为根据。实验所表达构建1 188 bp 的人骨形态发生蛋白2基因，包含有69 bp的信号肽、777 bp的中间前肽及342 bp的成熟肽的，是个能表达分泌到胞外的、功能性的蛋白基因的完整序列9。虽然细胞表达基因蛋白的影响因素比较多且不稳定，但此次实验设计应用RT-PCR、免疫酶斑点(dot-ELISA)检测及免疫组织化学染色法能粗略地对基因序列RNA转录水平进行半定量及定性检测。实验选用构建的真核表达载体系统pcDNA3-hBMP2同时编码有Ampr和Neor基因，利用载体内的Ampr抗性基因，能在氨苄青霉素(Ampicilin)中筛选转化成功的大肠杆菌菌株，克隆并扩增目的基因。利用Neor抗性基因的表达，可在G418等新霉素类药物中培养筛选转染成功有抗性基因载体的人骨髓间充质干细胞种子细胞。实验中先通过对正常人骨髓间充质干细胞的全部被杀死的最小药性浓度，确定转染后G418筛选质量浓度为250 mg/L。在此种浓度下，培养2周以上，仍能存活的细胞克隆被认为是转染成功的、能表达Neor抗性基因和人骨形态发生蛋白2目的基因的人骨髓间充质干细胞。实验发现，实验组细胞在增殖生长方面与空白对照组几乎无差别，转染后G418的筛选纯化使细胞数量急剧减少，约只占非筛选组细胞的30%左右。筛选成功后，去除G418正常培养，转染筛选后细胞数量上较少，但仍能保持良好的增殖能力。外源性人骨形态发生蛋白2能够促进细胞所需功能的增强比如碱性磷酸酶活性，诱导细胞成骨分化，促进骨组织再生，这得到了大量既往研究的证实8，28。细胞分化过程与细胞增殖密切相关，当细胞去分化时，细胞功能受到抑制而增殖更加活跃；当细胞高度分化时，处于合成分泌特殊物质(蛋白质和酶)的状态，细胞的功能被充分表达出来，而其增殖活性受到抑制29。实验中利用MTT比色检测发现，转染细胞的增殖变慢，但代表细胞成骨分化标志的碱性磷酸酶比活性明显增高，这也就说明转染后细胞能分泌目的基因，向成骨分化的功能加强，而同时其增殖活性受到部分抑制，这也同样符合构建基因种子细胞的初始目的，也就是同时实现成骨因子缓释和提供可诱导成骨分化的骨前体细胞，满足骨再生修复的基本要素。来自于外源性基因表达产物、基因载体及干细胞的免疫原性是组织工程及基因治疗临床转化的重要障碍30-31。实验考虑以骨科临床转化使用为最终目的，通过一系列实验设计操作的优化来降低此类风险。实验采用微创取出的微量人肌肉组织扩增人骨形态发生蛋白2基因，构建含抗性筛选基因的真核表达载体，以利于筛选种子细胞，并且通过使用相对病毒载体具有更低免疫原性和风险性的质粒载体，转染由人骨髓分离培养来源间充质干细胞。同源基因在同源细胞内表达同源蛋白不具有免疫原性，使基因治疗结合组织工程能构建可稳定表达分泌人骨形态发生蛋白2的种子细胞，这种方法更为安全、更接近于临床转化应用。当然，如何避免基因经质粒转染细胞随着时间的推移表达人骨形态发生蛋白2蛋白逐渐减少，以及如何建立更为安全稳定有效的基因修饰的种子细胞，以构建组织工程骨转化临床应用，还需要进一步更加深入的研究。致谢：论文在构思和书写过程中得到北京大学深圳医院骨科研究中心黄永灿博士的支持，特此致谢。作者贡献：实验设计为俞莉敏，实验实施为马俊轩、俞莉敏，实验评估与审阅为李继云、于滨生，俞莉敏成文。利益冲突：所有作者共同认可文章无相关利益冲突。伦理问题：实验方案经北京大学深圳医院伦理委员会批准同意后进行。研究用人体组织的实验方案符合相关伦理学要求，文章的撰写与编辑修改后文章遵守了国际医学期刊编辑委员会学术研究实验与报告和医学期刊编辑与发表的推荐规范。文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。文章外审：文章经国内小同行外审专家双盲外审，符合本刊发稿宗旨。作者声明：文章第一作者对于研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。开放获取声明：这是一篇开放获取文章，文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。根据知识共享许可协议“署名-非商业性使用-相同方式共享3.0”条款，在合理引用的情况下，允许他人以非商业性目的基于原文内容编辑、调整和扩展，同时允许任何用户阅读、下载、拷贝、传递、打印、检索、超级链接该文献，并为之建立索引，用作软件的输入数据或其它任何合法用途。4 参考文献 References1 Bueno EM,Glowacki J.Cell-free and cell-based approaches for bone regeneration. 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