维生素K与维生素A对患维生素D3过多症的成年大白鼠体内短期毒性的调节保护效应的比较.docx

维生素K与维生素A对患维生素D3过多症的成年大白鼠体内短期毒性的调节保护效应的比较背景/目的：由于在多维生素制剂中广泛使用，维生素D3毒性风险大大增加。维生素K和维生素A对维生素D发挥作用有着重要作用，本研究的目的是通过检测实验大白鼠血清中钙的含量，心脏酶的变化，进行肾功能测试，和观察相关组织的病理学变化，来比较维生素K和维生素A对维生素D3过多症毒性作用的调控和保护效应。材料与方法：把80只成年大白鼠分成四组，每组20只。给第一组提供水，第二组提供中毒剂量的维生素D3，第三组提供中毒剂量的维生素D3和维生素A，第四组提供中毒剂量的维生素D3和维生素K。结果：维生素D3中毒导致心肌酶和肾功能测试明显异常，肾脏、心脏、肾上腺和主动脉中的血清钙也发生了病理变化。个别服用了维生素A或者维生素K与毒性剂量的维生素D，使得维生素D3过多症在生化和病理学上的致畸作用得到改善。结论：在对维生素D3过多症短期毒性的调节作用上，维生素A和维生素K具有相同的保护效应。关键词：维生素D3，维生素A，维生素K，维生素过多症。1. 前言虽然它们的量非常小，但是维生素是机体正常生长发育所必需的有机成分。大部分维生素人体自身并不能合成，靠从植物性和动物性食物中摄取获得。维生素分为脂溶性和水溶性两种，其中后者在机体中的排泄速度更快。维生素D不是一种单一的化合物，而是由两种不同脂溶性化合物合成而来。维生素D3（胆钙化甾醇）来源于动物，具有预防和治疗佝偻病的能力。维生素D2（麦角钙化醇）来源于植物。维生素D3的毒性剂量是维生素D2的10倍左右。维生素D3的中毒会导致机体软组织的钙化。维生素D在人体内以骨化二醇（25-羟胆钙化醇）的形式储存，并且分布广泛，有2029天的半存留期。维生素D和其代谢产物通过增加肠道对钙的吸收，刺激骨骼的再吸收，以及减少肾脏中钙的排泄流失，来维持机体正常的血钙水平。，有许多富含维生素D的食物，例如鱼肝油，大马哈鱼，鲭鱼，沙丁鱼，牛奶（全脂，脱脂和少脂），肝脏，牛肉和鸡蛋黄。现在，由于在婴儿和未成年人服用的多维生素制剂中过量使用，维生素D3中毒的风险大大增加。多种植物含有高浓度的维生素D或者其类似物，这成为家畜体内维生素D3的毒源。维生素D是所有维生素中毒性最大的，于是，在几个国家它被用于控制鼠类的生长繁殖。任何情况下，只要摄入超过1000 g/day (40,000 IU)就会发生中毒。在美国，仅2004年就有284起维生素D服用过量致死的案例，报告的死亡原因是由于维生素D3中毒导致心脏和肾脏衰竭。高剂量的维生素D2和维生素D3，会明显导致肾脏、血管、心脏和肺等软组织中，血钙含量过高和钙盐的沉积。这就会产生软组织的钙化和骨质疏松。机体重要的组织器官如果发生矿化，这会破坏它们的结构，降低它们的功能性。维生素K是一类脂溶性的化合物，在食物中主要含有维生素K1和K2，药物中是K3和K4。维生素K能够使得参与凝血过程的蛋白因子羧化，如凝血酶原，导致谷氨酰基上钙结合位点的形成（-羧谷氨酸，Gla）。骨骼中发现的Gla蛋白（骨钙蛋白）能够参与钙的转移和吸收。在其他组织，如肺、肾脏和脾脏中，也发现了Gla蛋白的基体。维生素A是一类脂溶性化合物，其需求量用同等视黄醇的量来表示。维生素A被认为是参与维生素D反应的重要因子。通过进食或者紫外光照射摄取的维生素D，会耗尽血液和肝脏中储存的维生素A。一些研究表明，维生素D摄入过多会导致相关性的维生素A缺乏。其他研究者称，维生素A作用于维生素D的受体。在维生素D摄入量过高时，维生素A、K和D的结合使用被认为具有保护机体软组织钙化的作用。这项研究的目的是通过检测实验大白鼠血清中钙的含量，心脏酶的变化，进行肾功能测试，和观察相关组织的病理学变化，来比较维生素K和维生素A对维生素D3过多症毒性作用的调控和保护效应。2. 材料和方法从阿德贝尔阿齐兹国王大学动物所购买的，80只体重200-300g的成年健康大白鼠。大鼠暴露于12小时的光/暗循环，实验期间，它们能自由进食和喝水。把80只成年大白鼠分成四组，每组20只。给第一组提供蒸馏水；第二组注射单一中毒剂量的维生素D3（2mg/kg）；第三组除注射中毒剂量的维生素D3（2mg/kg），还提供单一口服的维生素A棕榈酸酯（每日1000-9000IU/kg）；第四组除注射单一中毒剂量的维生素D3（2mg/kg），还提供单一口服的维生素K1（每日15mg/kg）。持续喂养一个月。蒸馏水和维生素A和K使用口管喂养；维生素D3使用由孟菲斯医药化工（埃及）生产的一次用量针剂注射，每剂2ml含有5mg维生素D3，相当于200,000IU；维生素K1注射由罗氏公司（英国）生产的，浓度为10mg/ml的针剂1ml；维生素A是用50,000IU的由卡西拉医药化工（埃及）生产的胶囊。2.1.血液样品的采集在实验结束时，将大鼠用乙醚麻醉，从眶窦毛细血管获得血液样本。将样品放入离心机，在3000转/分，4下离心10分钟，分离出血浆，检测其中的肾功能标志物（脲素和肌酸），血清钙含量，以及心肌酶（肌酸激酶同工酶（CK-MB）、肌钙蛋白I（cTnI），和肌红蛋白）。脲素和肌酸使用商品化试剂盒和临床自动量化分析仪的常规比色法来测定，血清钙是由钙比色法测定试剂盒中的浓度为0.4 - 100毫克/分升（0.1 - 25毫米）和575纳米的吸光度来测定。测定cTnI和CK-MB质量是通过使用Elecsys分析仪，确定cTnI统计第三代和CK-MB的统计方法（罗氏诊断，德国）来进行的。这些方法是基于电化学发光免疫分析技术（ECLIA），利用三明治形式使用两种小鼠单克隆抗体，分两步进行。根据制造商的指示说明，他们是基于Elecsys 1010和2010免疫分析仪进行的（罗氏诊断）。采用荧光酶联免疫分析法测定各层云肌红蛋白浓度（戴德波林公司，美国）。2.2.组织病理学研究所有大白鼠在最后一次注射维生素，过量麻醉24小时后都已经死亡。在心脏、胸、腹主动脉，肾，肺，肾上腺进行解剖，组织标本（心、肺、主动脉、肾、肾上腺）存放于10福尔马林的中性缓冲液中。对固定标本进行修剪，洗净，并提升酒精浓度；清除二甲苯；石蜡包埋；进行切片在4到6米的厚度；用苏木精和伊红染色和Von Kossa染色。2.3.数据分析数据分析使用SPSS 17版，结果的变异性表现为标准差（SD）。结果采用单因素方差分析，事后多重比较检验（Tukey检验），和一个配对样本t检验分析组间差异。一个0.05的值也会被认为是存在显著差异。2.4.伦理方面的考虑大白鼠是最适合这项研究的动物物种，实验中对其进行了高标准的护理。样本容量通过可以获得最有效结果的最少动物数量计算得来。对大白鼠的手术是在麻醉状态下进行的，以减少其痛苦。我们的动物护理和管理标准符合国际法律和法规的要求。3. 实验结果3.1.组织病理学观察显微照片如图1-10所示。3.1.1显微镜下肺组织病理学检查从对照组肺切片检查（1组）显示正常的肺泡与肺泡间隔清晰可见，肺泡囊（图1A和2A）。然而，对第二组中的大鼠肺组织，接受2毫克/千克的维生素D3，发现相对于对照组显著变化，这些变化在肺泡及肺泡间隔有钙盐沉积形成，淋巴细胞浸润，巨噬细胞和中性粒细胞，几个大细胞增厚间隔，明显的出血、气肿、水肿。Von Kossa染色显示钙化肺组织支气管和肺泡间隔，以及其他肺组织广泛的矿化（图1b和2b）。在第三组大鼠肺组织切片，接受2毫克/千克的维生素D 3与每天10009000 IU/kg维生素A，和那些在第四组，接受2毫克/公斤的维生素D3和每天15毫克/公斤维生素K1，发现没有什么差别（图1C和2C，和图1D和2D，分别显示）。3.1.2显微镜下心脏组织病理学检查从对照组心肌切片检查显示心肌的正常形态、分支和吻合的心肌纤维的肌浆，嗜酸，和中央细长的水外核（图3A和4A）。然而，在第二组大鼠心肌组织，接受2毫克/千克的维生素D3，显示与心肌纤维变性心肌正常结构破损和功能衰退；钙方法：心外膜、心肌、心内膜、心瓣膜、冠状动脉；与淋巴细胞浸润的心脏肌肉变性和纤维化（图3B和图4B）。在第三组大鼠的心脏部分，接受2毫克/千克的维生素D3和每天 10009000 IU/kg维生素A，与第四组中，接受2毫克/千克的维生素D3每天15毫克/公斤维生素K1，显示相同的心肌正常外观，分支和嗜酸性肌吻合术心肌纤维，拉长的泡状核和中央那些在第一组中的相同（图3C和4C，和图3D和4D，分别显示）。3.1.3显微镜下主动脉组织病理学观察从对照组主动脉切片检查显示主动脉壁的成分正常（内膜、中膜和外膜，）（图5A和6A）。然而，在第二组大鼠主动脉组织，接受2毫克/千克的维生素D3，显示正常主动脉结构损坏，与主动脉壁断裂、变性，和中膜弹力纤维与钙沉积分离（图5B和6B）。相反，第三组的主动脉段，接受2毫克/千克的维生素D3 10009000 IU/kg每天维生素A，而第四组接受2毫克/千克的维生素D3和每天15毫克/公斤维生素K1，未见病理主动脉壁成分异常（图5c和6c和图5D和6D，分别显示）。3.1.4显微镜下肾组织病理学检查从对照组肾脏切片检查，组织学特征显示完全正常的，如图7a、8a所示。另一方面，第二组肾段，接受2毫克/千克的维生素D3，显示部分肾小球的血管收缩，肾小球囊腔的密封性变性，大多数肾小管上皮组织发生矿化（症），皮质和髓质钙化性肾小管上皮细胞畸变（图7b和8b）。在第三组的肾部分，收到2毫克/千克维生素D3 10009000 IU/kg每天维生素A，并在第四组，其中收到2毫克/千克的维生素D3和每天15毫克/千克维生素K1，皮质和皮质无异常，肾结构髓质观察正常（图7C 和8C，和图7D和8D，分别显示）。3.1.5显微镜下肾上腺组织病理学检查从对照组肾上腺切片检查，显示组织结构正常（图9a、10a）。然而，在第二组大鼠肾上腺组织，接受2毫克/千克的维生素D3，出现空泡化肾上腺皮质细胞髓质发生钙沉积（图9B、10B）。在第三组肾上腺部分，接受2毫克/千克的维生素D3 10009000 IU/kg每天维生素A，和第四组肾上腺节，收到2毫克/公斤的维生素D3和每天15毫克/公斤维生素K1，无异常病理表现（图9C和10C，和图9和10，分别显示）。3.2生化检查结果表1表示大鼠肾功能试验中的平均值。对照组、第三组、第四组尿素平均值为31.1、8.49、49.6、26、1.76、34.4、2.07。F值，这表明组间差异显著，为100.7，P0.001。对照组、第三组、第四组肌酐平均值为0.91，0.28，0.66，0.18，0.70，0.11，0.28，0.14。F值，组间差异均为36.38，差异显著，P0.001。表2表示大鼠心肌酶的平均值和平均值。对照组，第二组、第三组、第四组的cTnI平均SD值分别为0.0020.001、0.760.014、0.004和0.1650.0005、0.164。F值，组间差异均为22302.43，差异显著，P0.001。对照组，第二组、第三组、第四组的CK-MB平均SD值分别为1.900.64、22.11.37、1.450.510以及0.1650.164。F值，组间差异均为3044.05，差异显著性，P0.001。对照组，第二组、第三组、第四组的肌红蛋白平均SD值分别为121.670.60、296.721.33、126.410.229以及129.350.268。F值，组间差异均为257381.93，差异显著性，P0.001。图11为大鼠血清钙的平均值。对照组，第二组（维生素D3），第三组（维生素D3和维生素A），第四组（维生素D3和维生素K1）的血清钙的平均SD值，分别为9.880.19、20.160.57、10.550.28、10.470.24。P0.001具有重要意义。4. 讨论当长期服用维生素或者一次服用剂量过高时，会发生维生素中毒。维生素过多症通常是脂溶性维生素引发，如维生素D，因为它们容易在体内积聚。通常引发，尽管维生素D3具有广泛的治疗指数，但由于缺乏医生明确诊断的用药剂量，而被过量使用，易引发维生素D3过多症。医生建议每天服用高剂量维生素D3持续数周，来为慢性骨疾病（骨软化和骨质疏松症）和自身免疫性疾病如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、银屑病治疗，原因与他们血液中维生素D的代谢水平低有关；因此，他们患维生素D3过多症的发病率可能会增加。医生还建议，长期以来每日服用高剂量维生素D3，可以作为治疗上皮性恶性肿瘤如乳腺癌和结肠癌，以及降低乳腺癌的复发和死亡的预防卵巢癌的有效方法。因此，本研究探讨维生素D3