现代分离分析技术在农药残留分析中的应用.doc

现代分离分析技术在农药残留分析中的应用摘要：本文介绍了四种农药残留分析技术，并重点介绍了当代先进的分离分析技术酶免疫分析技术的原理、类型、方法的开发以及在农药残留分析中的应用。关键词：酶免疫分析；农药残留农药的使用无疑大大提高了农作物的产量，但由此而产生的环境污染问题，已引起人们的高度重视。世界上许多国家都规定了食品、粮食中各种农药残留的限定量。多年来，气相色谱、高效液相色谱、质谱等方法已经非常成功地应用于环境分析，能精确地检测残留的农药量。然而，它们需要昂贵的仪器设备、复杂的前处理、熟练的技术人员及较长的分析周期。因此，人们迫切希望一种简单、快速、灵敏、价廉的检测技术，能在野外或实验室内进行大批量的检测和筛选试验。酶免疫分析(EIA)技术就此脱颖而出，尤其在农药残留分析领域，应用十分广泛1。1 农药分析技术简介常用的农药分析方法包括：分光光度测定法，色谱法，毛细管电泳法，电分析方法，发光分析方法，非水滴定法，免疫分析法2。1.1 分光光度法在较早时期，分光光度法分析过程中没有分离步骤，因此颜色反应的特异性就成了目标化合物定量分析的主要因素。如环境中总涕灭微残留量可用氮基甲酰肟基团的特殊反应来测定。这种方法由于其操作烦琐，灵敏度低，易受其他物质干扰，故现很少使用。分光光度法的优点是设备简单，适用于基层生产单位及一般实验室。1.2 色谱法 色谱法是一种分离方法，其利用物质在两相中的分配系数的微小差异进行分离。当互不相溶的两相做相对运动时，被测物质在两相之间进行连续多次分配，这样原来微小的分配差异被不断放大，从而使各组分得到分离，最终达到分离、分析或测定物质一些物理化学常数的目的。色谱法主要有：薄层色谱法（TLC），气相色谱法（GC），高效液相色谱法（HPLC）。TLC法是一种较成熟、应用也较广的微量快速检测方法，可同时分析多个样品，多用于复杂混合物的分离和筛选。先用适宜的溶剂提取农药，经纯化浓缩后，在薄层硅胶板上展开分离，显色后与标准样比较Rf值进行定性测定。TLC除了用特殊的显色剂观察斑点颜色和用Rf值定性外，与其他技术的连用不仅可以定性，而且可对样品中被分离的一种成分进行定量分析。气相色谱的流动相为气体，一般适合于低沸点、热稳定性较好的化合物的分离检测。它的特点是高效、快速和灵敏，其分离分析复杂化合物的能力是以前其它色谱无法比拟的，应用相当广泛。高效液相色谱具有分离效率高，分析速度快，检测灵敏度高和应用广泛的特点，特别适合于高沸点、大分子强极性和热稳定性差的化合物的分离分析。对于受热易分解或失去活性的物质，可用HPLC分析。此外，色谱-质谱联用技术是当代最重要的分离和鉴定的分析方法之一，既发挥了色谱的高分离能力，又发挥了质谱的高鉴别能力。这种技术适用于多组分混合物中未知组分的定性分析。目前应用较多的是气相色谱-质谱(GCMS)联用，但GC要求样品具有一定的蒸气压，只有20的样品可不经过预先的化学处理满足用气相色谱分离，多种情况下所研究的药物需要经过适当的预处理和衍生化。1.3 毛细管电泳法（CE） 毛细管电泳根据其原理可分为：毛细管区带电泳(简称CZE)、毛细管凝胶电泳(简称CGE)、毛细管胶束电动电泳(简称MECC)、毛细管等电聚焦电泳(简称IEF)、毛细管等速聚焦电泳(简称TIP)。由于毛细管电泳具有分离效率高、快速、样品用量少等特点，近年来得到了迅速的发展。在农药残留分析中应用较多的主要有CZE和MECC。农药按防治对象不同可分为除草剂、杀虫剂、杀菌剂，从结构上讲又可分为手性和非手性农药。由于它是由结构差异很大的有机化合物组成，其中很多还是几何、光学异构体或对映体，在水中的极性、溶解度、离子化程度各不同，因而其分离模式就有一定差别。CZE分离的农药主要是在水溶液中呈离子态的或可离子化存在的化合物，其分离原理主要是它们在形状或质荷比上的差异，故毛细管区电泳非常适用于那些常规液相色谱难以分离的离子型化合物，其分离效率可达数百万理论塔板数，操作简便，具有很大灵活性。 这些方法需要昂贵的仪器设备、复杂的前处理、熟练的技术人员以及较长的分析周期。因此人们迫切希望有一种快速、简单、灵敏、廉价的检测技术。能在野外或实验室内进行大批量的检测和筛选试验。酶免疫分析(EIA)技术就此脱颖而出，尤其在农药残留分析领域，应用十分广泛。2 酶免疫分析方法免疫学检测技术是近几年发展起来的新技术。这种方法是将免疫反应和现代测试手段相结合而建立的超微量测定技术。免疫是机体识别和排除进人体内的抗原性异物的保护性应答反应。免疫分析法就是基于抗原抗体的特异性识别和结合反应为基础的分析方法。分子量大的农药(如苏云金杆菌毒素等)可以直接作为抗原免疫动物，动物的免疫系统对进入体内的异源大分子量物质发生保护性应答反应。分子量小的农药(MW2 500)一般不具备免疫原性，不能刺激机体产生免疫反应，但有与相应抗体在体外发生吸附反应的能力，即有反应原性，这类小分子物质在免疫学上称为半抗原。将农药小分子以半抗原的形式连接到分子量大的载体蛋白上，形成农药-载体蛋白结合物免疫原，即人工抗原，以人工抗原免疫动物，使动物的免疫系统发生应答反应，产生对该农药具有特异性的活性物质免疫球蛋白(即抗体)，来识别该农药分子并与之结合，这种反应不仅可在体内进行，也可在体外进行。这种方法具有简单、快速、灵敏度高、特异性强、价廉、样品所需量少等优点，已迅速发展成为生物化学、医学、药物化学等研究领域的重要工具1,3,4。免疫分析方法被称为是使用抗体作为“生物化学检测器”的分析技术5。为了揭示微量抗原与抗体的免疫学反应，需要引入一个示踪物，通常使用的有放射性同位素、酶和荧光素，根据示踪物的不同，分别称为放射免疫分析(RIA)技术、酶免疫分析(EIA)技术和荧光免疫分析(FIA)技术。由于EIA技术较为安全、稳定、灵敏，故其应用最为广泛6。2.1 农药酶免疫分析方法类型及原理酶免疫分析法是用酶标记抗原、半抗原或抗体而建立的方法。根据其特点和步骤可分为酶联免疫吸附测定法(ELISA)和酶放大免疫测试法(EMIT) 。 ELISA是一种主要的免疫分析方法，又可分为直接竞争法、问接竞争法、双抗体夹心法和间接夹心法。直接竞争法是将抗体包被到聚苯乙烯微孔反应板上，加人酶标记农药和待测农药，酶标记农药和待测农药之间与抗体的竞争而发生结合反应。由于待测农药多，则反应后被吸附到反应板上的酶标记农药少，即吸附到酶反应板上的酶标记农药的量与待测液中农药的含量成反比。加人酶底物显色后，进行比色，可以测定待测农药含量。间接竞争法的前一部分与抗原包被直接竞争法相同，只是不用酶标记农药抗体(一抗)，而是标记第二抗体，在竞争反应结束后，加入酶标二抗，发生一抗与酶标二抗的结合反应，被结合的酶标二抗的量与包被抗原结合的一抗的量的变化趋势是一致的，即被结合的酶标二抗的量与待测农药的含量成反比。此方法的优点是一个农药抗体可以结合多个酶标二抗，大大提高了方法的灵敏度。双抗体夹心法7,8是将抗体包被固相载体，加入待测抗原使其与过量的固相抗体结合，再加入过量的酶标记相同的抗体，分离固相和游离相的化合物，加入底物，据显色程度来求出样品中抗原的含量。间接夹心法是将样品中的抗原结合于过量的固相抗体，加入过量的同种抗体(一抗)，洗涤后加入酶标二抗，最后加入底物反应，据显色程度确定待测抗原的含量。EMIT是一种经典的均质酶免疫测试技术。基本原理是用特定的酶标记待测农药，然后将抗体、酶标记农药、待测农药同时加人反应试管中进行竞争反应。酶标记的待测农药与抗体结合后，酶被抑制而失去活性。样本中待测农药越多，则游离的未被抑制的酶也越多，根据吸附反应后酶活性的改变可以测定出农药的含量。该法的缺点就是每一种待测农药都必须进行酶标记，限制了该法的推广应用。2.2 抗体、抗原的合成（1）免疫原的合成和酶标抗原的制备半抗原的农药小分子只有偶联到载体蛋白上，才能诱导机体产生免疫应答反应。因此，在制备抗体前首先要合成农药-载体蛋白结合物免疫原。载体蛋白不仅仅是增加半抗原的相对分子质量，也不是单纯的起运载作用，而是依靠本身的结构特异性免疫原性，才能诱导体液抗体的产生以及继而诱导对半抗原农药分子的识别，这种现象称为载体效应9(carrier effect)。常用的载体蛋白有牛血清白蛋白、人血清白蛋白、兔血清白蛋白、卵清蛋白和钥孔血清蓝蛋白等。如何将半抗原的农药小分子偶联到大分子的载体蛋白上，人们进行了许多研究工作，建立了多种偶联方法。一般都是利用小分子上的活性部位与蛋白质上的氨基、羧基、酚基、巯基或羟基进行化学反应。经常采用的偶联反应有重氮化法、碳二亚胺法、混合酸酐法、戊二醛法等。农药衍生和连接的化学反应条件不应导致半抗原分子结构发生明显改变，否则抗原性将发生变化10。另外，制备好的半抗原结合物在免疫动物前，要测定结合物中半抗原数目，因为结合物中半抗原分子数目太多或太少，诱发抗体的能力都很差。用于合成农药-载体蛋白结合物的方法，在不引起酶失活的情况下，通常都可用来连接酶与农药，制备酶标农药抗原。（2）抗体的类型及合成 抗农药抗体分单克隆抗体和多克隆抗体。多克隆抗体可用农药一载体蛋白结合物直接免疫兔子等动物，从被免疫的动物血清中来获得。这种抗体用于免疫分析效果良好，但缺点是抗体不均一，来源是间断的，有较大的批间差别。自20世纪7O年代发展单克隆抗体技术，至今已日益成熟。单克隆抗体是指在一株B淋巴细胞系中的每个细胞只能产生一种专有的、针对一种它能识别的抗原决定簇的抗体。由这样一株B细胞系产生的抗体即为单克隆抗体。由于它是针对抗原某一决定簇的，因而是一种均质的高特异性抗体，并且可以在体外培养液中继续培养，或接种在小鼠腹腔内传代。单克隆抗体虽然生产成本高。技术复杂，但其特性稳定，交叉反应少，可大批量生产。3. 酶免疫分析技术在农药残留分析中的应用 EIA技术可以用于检测水、土壤、食品中的各种农药残留，方法简便、快速、前处理程序简化(不需净化)，反应既可在试管中进行，也可在微孔板上进行；若在96孔板上，每次可分析几十个样品，且可同时作出标准曲线。目前应用最多的是酶联免疫吸附(ELISA)测定法。Selisker11等采用竞争ELISA法用兔抗百草枯抗体包被磁株固相检测百枯，从各种水果和蔬菜中提取百草枯只用30 min，检出限为10 ngg-1。，平均回收率达99%，而用分光光度计法样品提取则需5 h，两种检测方法相关系数达0.994。Schlaeppi12等运用直接竞争EI ISA法和间接竞争ELISA法分别检测土壤中的异丙甲草胺，产生的抗异丙甲草胺单克隆抗体有极强特异性，与其代谢产物无交叉反应，直接和间接竞争ELISA法对土壤中异丙甲草胺的回收率分别为98%和89%。Brandon13等在1994年制备了一种可以与苯并咪唑类药剂(丙硫多菌灵、芬苯达唑、奥芬达唑及它们的代谢物) 结合的单克隆抗体，该抗体也可与甲基苯并咪唑氨基甲酸酯(苯菌灵的一种代谢物)结合。新的半抗原5(6)一(羟基戊基一硫代)一2一苯并咪唑氨基甲酸酯可在大鼠体内得到，这种改进了的ELISA法可以检测苯并咪唑及多种农药，检出限为1-8gkg-1。我国的研究者也自行开发了许多EIA检测方法14： 成功地合成了对硫磷人工抗原，并在免疫的兔子体内获得高效抗血清。在此基础上，应用了ELISA法对梨、苹果中的对硫磷残留量进行检测，并以GC法验证，充分说明其具有良好的重现性。 通过化学方法，将杀虫脒偶联到载体蛋白上制成抗原，然后免疫BALBC小鼠。经细胞融合、筛选、克隆等步骤，获得了抗杀虫脒的特异性抗体，并以该抗体建立了大米中杀虫脒残留量的单克隆抗体ELISA检测方法。 应用B淋巴细胞杂交瘤技术，研制出特异性强的T-2毒素的单克隆抗体，并建立了小麦T-2毒素的ELISA检测方法。表1-3列出了国内外有关水、土壤、食品中部分除草剂、杀菌剂、杀虫剂类农药残留的酶免疫技术检测的方法类型、检出限、抗体类型、检测范围和农药种类等有关情况。表1 除草剂酶免疫技术检测Tab.1 Enzyme immunoassays applied to weed killer除草剂种类检测方法抗体类型检测样品种类检出限文献阿特拉津ELISA-kitELISAELISAPolyPoly牛肉、牛肝、猪油水土壤1gKg-10.018-0.022gL-10.018-0.24gL-1131415西玛津ELISAPoly0.5ngmL-116扑草净ELISAPoly2 ngmL-116莠去津ELISAPoly1 ngmL-116甲草胺ELISA-kit牛肉、猪油1gKg-113百草枯ELISAPoly水果、蔬菜10gKg-192，4-DELISA-kit tube牛肉、牛肝、猪油1.14gKg-113绿麦隆ELISA水0.015mgL-117表2 杀菌剂酶免疫技术检测Tab.2 Enzyme immunoassays applied to bactericides杀菌剂种类检测方法抗体类型检测样品种类检出限文献多菌灵ELISA-kit tube牛肉、猪油5gKg-113涕必灵ELISAMono马铃薯、苹果200gKg-118百菌清ELISAPoly西红柿、苹果0.030 0.068mgg-119苯并咪唑类ELISAMono肝1 -8gKg-111三唑酮ELISA黄瓜、梨40ngg-120表3 杀虫剂酶免疫技术检测Tab.3 Enzyme immunoassays applied to insecticides杀虫剂种类检测方法抗体类型检测样品种类检出限文献杀螟松ELISA谷物100gKg-12乙基虫螨磷ELISA谷物30gKg-12克百威ELISA-kit tubePoly奶、肉、肝100gKg-121ELISA-kit tube肉1gKg-113涕灭威ELISA-kit tubePoly奶、肉、肝4-380gKg-121氯菊酯ELISA谷物1.5gL-117 EIA技术还可以与其它技术如色谱、流动注射技术、超临界流体提取技术等联用，从而使之具有更好的选择性、灵敏性和快速测定等特点。Kricka等将EIA技术与流动注射分析技术相结合，检测水中的三嗪，检测灵敏度为0O2O3gL-1，分析所需时间由ELISA的15 h缩至65 min。DoschM等于1995年利用SFE-EIA联用技术将土壤中与腐殖酸结合的农药残留提取并测定，检出限在1O-910-12g之间。EIA技术与气相色谱质谱(GCMC)的联用可以减少结构相似农药或代谢产物测试中的交叉反应，以降低假阳性。有研究者认为15，把几种结构相关或非相关的农药抗体结合，利用这种混合技术进行几种农药的多残留分析，对于检测大批量且农药污染又没有规律的样品，可以节省大量的时间和工作量。农药残留的免疫分析方法是临床免疫法在分析化学领域的延伸16。十多年来，EIA技术在农药残留分析领域中已取得了极大的进展。有文献报道国内外已经开发出杀虫剂、杀菌剂、除草剂等4O余种农药的酶免疫分析方法。其中用于田间快速筛选的酶免疫分析试剂盒已商品化。这种方法具有快速、简单、灵敏、选择性高等优点，不仅可用来定性筛选，而且可以用来定量分析，灵敏度可