蛋白质含量测定(微量)-专业实习1.doc

蛋白质的定量测定（微量）实践目的通过本实践培养学生的动手操作能力，主要实训分光光度计（可见光、紫外光）的操作，比色皿的选择及科学清洗方法，掌握蛋白质不同测定方式的方法考马斯亮蓝染料结合比色法测定原理考马斯亮蓝G-250是一种染料，在游离状态下呈红色，最大吸收峰在465nm。它能与蛋白质的疏水微区通过范德华力相结合，这种结合具有高敏感性，主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合，染料与蛋白质结合迅速，大约为2分钟，结合物的颜色在1小时内稳定，结合物为后变成深蓝色，最大吸收峰变为595nm。蛋白质含量在0.01-1.0mg/ml范围内，蛋白质-染料复合物在595nm处的吸光度与蛋白质含量成正比，符合比尔定律，可用比色法测定。蛋白质-染料复合物具有很高的吸光值，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度，最低检出量为1g蛋白。一些阳离子如K+，Na+，Mg2+，(NH4)SO4和乙醇等物质不干扰测定，而大量的去污剂（如TrionX-100，SDS等）严重干扰测定，少量的去污剂可通过设计适当的对照实验而消除。由于本法操作简便，快速，灵敏度高，稳定性好，是一种测定蛋白质含量的常用方法。测定所需器材及试剂器材：722S分光光度计；试管；移液管；容量瓶；离心机；离心管；洗耳球试剂：1、标准蛋白质溶液：称取10mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水中并定容至100ml，制成100g/ml的溶液。2、考马斯亮蓝G-250试剂：称取 100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml 95乙醇中，加入85% (m/v) 的磷酸100ml，最后用蒸馏水定容到1000ml。此溶液可在常温下放置一个月。该染液可保存数月，如果不用水稀释可长期保存，一般在使用前稀释。测定过程1、绘制标准曲线取6支干燥洁净的大试管，编号，按下表加入试剂。管号123456标准蛋白溶液（ml）0.00.20.40.60.81.0蒸馏水（ml）1.00.80.60.40.20.0考马斯亮蓝G-250试剂（ml）555555蛋白质含量（ug）020406080100A595nm上述试剂加完后，混匀，室温静置2min，以第1管为对照，在595nm处比色，读取各管吸光值，以牛血清白蛋白含量为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。2、样品测定1） 样品中蛋白质的提取称取新鲜绿豆芽下胚轴（或小麦叶片）0.5-1.0 g放入研钵中，加2ml蒸馏水研磨成匀浆，转入到离心管中，再用6ml蒸馏水分次洗涤研钵，洗涤液收集于同一离心管中，在室温（20-25）下放置0.5-1 h以充分提取，然后在4000 rpm离心20 min，弃去沉淀，上清液转入50ml容量瓶，并以蒸馏水定容至刻度，即得待测样品提取液。2）样品中蛋白质含量的测定准确吸取1ml样品溶液于一支干燥洁净的试管中，加入考马斯亮蓝G-250试剂5ml，摇匀，室温静置2min，以标准曲线1号管为对照，在595nm处比色，记录吸光值。结果计算：样品中蛋白质含量（mg/g鲜质量）=（X*VT*N)/(W*VS*1000) =(X/VS*VT)/(1000*W)*NX：根据样品的吸光度所查的标准曲线值（蛋白质质量ug）VT：提取液总体积（ml）W：样品鲜质量（g）VS：测定时加样量（ml）N：稀释倍数【注意事项】1、 在试剂加入后的5-20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。2、 测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色皿壁，测定完后用95%乙醇将蓝色的比色皿洗干净。3、 由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考马斯亮蓝染色法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用G-球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。4、 考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量虽然干扰物质少，但仍有一些物质会干扰测定，主要的干扰物质有去污剂，如Triton-100、SDS；高浓度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵等。5、 缓冲液浓度过高改变测定液PH会影响显色。考马斯亮蓝染色能力很强，比色杯不洗干净会影响光吸收值，注意不可使用石英比色杯。紫外吸收法实践原理蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。低浓度的盐，例如生化制备中常用的（NH4）2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测，因为此时只需测定蛋白质浓度的变化，而不需知道其绝对值。此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法，加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。此外，进行紫外吸收法测定时，由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化，因此要注意溶液的pH值，测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。实践器材及试剂器材：1、 紫外分光光度计；2、容量瓶50ml；3、试管；4、吸管；5、洗耳球试剂：1、 标准蛋白质溶液：称取10mg牛血清白蛋白，溶于生理盐水中并定容至100ml，制成100g/ml的溶液。2、 待测蛋白质溶液：稀释血清（或其它蛋白样品溶液），准确吸取0.1ml血清，置入50ml容量瓶中，用生理盐水稀释至刻度（此为稀释500倍，其它蛋白样品酌情而定）。实践过程方法一：280nm和260nm的吸收差法核酸对紫外光有很强的吸收，在280nm处的吸收比蛋白质强10倍（每克），但核酸在260nm处的吸收更强，其吸收高峰在260nm附近。核酸260nm处的消光系数是280nm处的2倍，而蛋白质则相反，280nm紫外吸收值大于260nm的吸收值。通常：纯蛋白质的光吸收比值：A280/A2601.8纯核酸的光吸收比值：A280/A2600.5含有核酸的蛋白质溶液，可分别测定其A280和A260，由此吸收差值，用下面的经验公式，即可算出蛋白质的浓度。蛋白质浓度=1.45A2800.74A260 (mg/ml)此经验公式是通过一系列已知不同浓度比例的蛋白质（酵母烯醇化酶）和核酸（酵母核酸）的混合液所测定的数据来建立的。方法二：215nm与225nm的吸收差法蛋白质的稀溶液由于含量低而不能使用280nm的光吸收测定时，可用215nm与225nm吸收值之差，通过标准曲线法来测定蛋白质稀溶液的浓度。用已知浓度的标准蛋白质，配制成20100 g/ml的一系列5.0ml的蛋白质溶液，分别测定215nm和225nm的吸光度值，并计算出吸收差：吸收差= A215A225以吸收差为纵座标，蛋白质浓度为横座标，绘出标准曲线。再测出未知样品的吸收差，即可由标准曲线上查出未知样品的蛋白质浓度。本方法在蛋白质浓度20100ug/ml范围内，蛋白质浓度与吸光度成正比，NaCl、（NH4）2SO4以及0.1M磷酸、硼酸和Tris等缓冲液，都无显著干扰作用，但是0.1N NaOH, 0.1M乙酸、琥珀酸、邻苯二甲酸、巴比妥等缓冲液的215nm光吸收值较大，必须将其浓度降到0.005M以下才无显著影响。比色皿的清洗清洁步骤：1、 比色杯用完后用大量的自来水冲洗2、 再用去离子水清洗，注意里外都要洗到。3、 95%乙醇清洗3、洗完后不要刻意的将比色杯擦干，虚放在比色杯盒内，不用盖上让其自然挥干。洗好的比色杯应当是透明，没有水迹的。注意：分析常用的铬酸洗液不宜用于洗涤比色皿，这是因为带水的比色皿在该洗液中有时会局部发热，致使比色皿胶接面裂开而损坏。同时经洗液洗涤后的比色皿还很可能残存微量铬，其在紫外区有吸收，因此会影响铬及其他有关元素的测定。对一般方法难以洗净的比色皿，还可以采取以下两种方法。A、 先将比色皿侵入含有少量阴离子表面活性剂的碳酸钠（20克/升）溶液泡洗，经水冲洗后，再于过氧化氢和硝酸（5：1）混合溶液中侵泡半小时。B、在通风橱中用盐酸、水和甲醇（1：3：4）混合溶液泡洗，一般不超过10分钟。C、比色皿不可用碱液洗涤，也不能用硬布、毛刷刷洗。比色皿使用注意事项：1、 拿取比色皿时，只能用手指接触两侧的毛玻璃,避免接触光学面。同时注意轻拿轻放，防止外力对比色皿的影响，产生应力后破损。2、 凡含有腐蚀玻璃的物质的溶液,不得长期盛放在比色皿中。3、 不能将比色皿放在火焰或电炉上进行加热或干燥箱内烘烤。4、 当发现比色皿里面被污染后，应用无水乙醇清洗，及时擦拭干净。5、 不得将比色皿的透光面与硬物或脏物接触。盛装溶液时，高度为比色皿的2/3处即可,光学面如有残液可先用滤纸轻轻吸附，然后再用镜头纸或丝绸擦拭。比色皿成组性测定：测量时如对比色皿有怀疑,可自行检测，方法如下：1、 将波长选择置实际使用的波长上，将一套比色皿都注入蒸馏水，将其中一只的透射比调至100%处，测量其他各只的透射比，凡透射比之差不大于0.5%，即可配套使用。2、 比色前将各个比色皿中装入蒸馏水，在比色波长下进行比较，误差在0.001吸光度以内的比色皿选出4-8个进行比色测定，可避免因比色皿差异造成测量误差。722S可见分光光度计的操作方法1、预热：为使仪器内部达到热平衡，开机后预热时间不小于30 分钟。开机后预热时间小于30 分钟时，请注意随时操作置0%(T)、100%(T)，确保测试结果有效。注意：由于仪器检测器（光电管）有一定的使用寿命，应当尽量减少对光电管的光照，所以在预热的过程中应打开样品室盖，切断光路。2、改变波长通过旋转波长调节手轮可以改变仪器的波长显示值(顺时针方向旋转波长调节手轮波长显示值增大，逆时针方向旋转则显示值减少)。调节波长时，视线一定要与视窗垂直。3、置参比样品和待测样品（1）选择测试用的比色皿；（2）把盛好参比样品和待测样品的比色皿放到四槽位样品架内；（3）用样品架拉杆来改变四槽位样品架的位置。当拉杆到位时有定位感，到位时请前后轻轻推拉一下以确保定位正确。4、置0%(T)目的：校正读数标尺的零位，配合置100%(T)进入正确测试状态。分光光度计的检测器是基以光电效应的原理，但当没有光照射到检测器上时，也会有微弱的电流产生（暗电流），调0%T主要用消除这部分电流对实验结果的影响。调整时机：改变测试波长时；测试一段时间后。操作：检视透射比指示灯是否亮。若不亮则按MODE 键，点亮透射比指示灯。打开样品室盖，切断光路（或将黑体置入四槽位样品架中，用样品架拉杆来改变四槽位样品架的位置，使黑体遮断光路）后，按“0%ADJ”键即能自动置0%(T)，一次未到位可加按一次)。5、置100%(T)目的：校正读数标尺的零位，配合置0%(T)进入正确测试状态。调整时机：改变测试波长时；测试一段时间后。操作：将用作参比的样品置入样品室光路中，关闭掀盖后按 “100%ADJ”键即能自动置100%(T)，一次未到位可加按一次。注意：置100%(T)时，仪器的自动增益系统调节可能会影响0%(T)，调整后请检查0%(T)，若有变化请重复调整0%(T)。6、改变操作模式本仪器设置有四种操作模式，开机时仪器的初始状态设定在透射比操作模式。应用操作1、测定溶液的透射比预热 设定波长 置参比样品和待测样品 置0%（T） 置100% （T） 选择透射比操作模式 拉动拉杆，使待测样品进入光路 记录测试数据2、测定溶液的吸光度预热 设定波长 置参比样品和待测样品 置0%（T） 置100% （T） 选择吸光度操作模式 拉动拉杆，使待测样品进入光路 记录测试数据3、运用A-C(吸光度-浓度)标准曲线测定物质浓度按照分析规程配制不同浓度的标准样品溶液并记录 按分析规程配制标准参比溶液 预热，改变波长，置参比样品和待测样品，置0%(T)，置100%(T) 选择吸光度操作模式 测出不同浓度的标准溶液和待测样品对应的吸光度，并记录各数组 根据不同浓度的标准溶液对应的吸光度数组手工绘制CA 曲线，或运用仪器的RS232C 接口配合仪器的专用软件拟合出CA 曲线 根据待测样品吸光度，在C-A 曲线上找出对应的浓度紫外分光光度计的操作方法1、 连接仪器电源线，确保仪器供电电源有良好的接地性能。2、 接通电源，开机使仪器预热20min。至仪器自动校正后，显示器显示“546.0nm 0.000A”仪器自检完毕，即可进行测试。3、 用方式键设置测试方式，根据需要选择，透过率（T），吸光度（A）浓度（C）4、 选择要分析的波长，按键6（设定键）屏幕上显示“WL=xxx.xnm”字样，按键1或键2输入所需要分析的波长，之后按键7（确认键）、显示器第一列右侧显示“xxx.xnm BLANKING”仪器正在变换到所设置的波长及自动调出0ABS/100%T请稍等。待仪器显示出需要的波长，并且已经把参比调成0.000A时，即可测试。5、 将参比样品溶液和被测样品溶液分别倒入比色皿中，打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿分别插入比色皿槽中，盖上样品室盖。一般情况下，参比样品放在第一个槽位中。仪器所附的比色皿，其透过率是经过配对测试的，未经配对处理的比色皿将影响样品的测试精度。比色皿透