生物光合作用中ATP合酶的催化作用机制2.doc

生物光合作用中ATP合酶的催化作用机制光合作用（photosynthesis)是地球上进行的最大的有机合成反应。它是指含光合色素（主要是叶绿素）的植物细胞和细菌，在日光下利用无机物质(CO2, H2O, H2S)合成有机化合物（C6H12O6），并释放出氧气(O2)或其他物质（如S等）的过程1。其一般化的表示形式为： （括号后加6）光合作用的场所是叶绿体，其过程分为两个阶段：第一阶段是光反应，第二阶段是暗反应。光反应在叶绿体的类囊体膜上进行，利用日光使H2O裂解，并生成高能磷酸化合物（ATP）和还原力（NADPH）。暗反应在基质中进行，利用光反应形成的ATP将CO2还原为糖。(缺少图1 说明)高等植物和藻类具有两个光系统：PS-和PS-。PS-以NADPH的形式提供还原力；PS-光解水生成氧气，并把释放的电子送入连接PS-1和PS-2的电子传递链。在电子传递过程中引起质子跨膜泵送和ATP合成。图1.叶绿体类囊体膜中质子和电子流的线路（光合磷酸化机制）。暗反应主要是CO2和H2O到糖的合成。以C3为例说明（图2），反应中CO2的受体是核酮糖-1，5-二磷酸，简称RuBP，此五碳糖与CO2结合，在核酮糖-1，5-二磷酸羧化/氧化酶的作用下，被裂解成2分子3-磷酸甘油酸（PGA）。PGA被ATP磷酸化、被NADPH还原，脱去1分子磷酸，产生3-磷二酸甘油醛（G3P）。在磷酸甘油酸激酶和ATP的作用下，生成1，3-二磷酸甘油酸，1，3-磷二酸甘油酸在NADP+-甘油醛-3-磷酸脱氢酶的作用下生成3-磷二酸甘油醛，经过一系列反应，G3P被重排成新的RuBP或者合成葡萄糖和其他其它糖类。暗反应过程有三步需要ATP提供能量，这些ATP由光反应阶段ATP合酶催化作用下合成提供。ATP合酶广泛存在于叶绿体、线粒体和细菌中。ATP合酶既能依靠质子动力势合成ATP，也能水解ATP 形成机体需要的质子梯度，研究ATP合酶的催化作用机理，尝试定向控制作用过程，对提高光合作用效率，进而提高农作物产量等具有很大指导意义。图2：暗反应-C3循环示意图图2：暗反应-C3循环示意图有关ATP合成的驱动力，1961年Mitchell提出化学渗透假说2，主要内容是线粒体内膜上呼吸链组分间氢与电子的交替传递，使质子（H+）从内膜内侧向外侧定向转移，由于膜对H+的不通透性，从而形成跨膜的质子梯度，或称为质子动力势，质子梯度作用于ATP合酶催化形成ATP。这个假说得到大量实验的验证和支持，从而获得1978年的诺贝尔化学奖。从分子层面上对ATP合酶催化机理进行探索，首先需要搞清楚ATP合酶的结构。ATP合酶主要由F1（深在膜外的水溶性部分）和F0（嵌入膜内）组成（图3）。F1 由a b g d e五种多肽链构成， 即a3b3gde ，三对a和b亚基以交替方式排列，构成ATP合酶的催化部位。 g, d, e亚基位于中央F0和F1的界面上，形成两个狭长的柄。由d亚基和F0的b亚基形成的柄将（ab)3与F0的a亚基连接在一起，g和e亚基相对地固定在一起，在酶的转换时一起旋转。F0由a, b, c三种亚基构成。最大的a亚基高度疏水，位于膜内。b亚基有一个疏水的N-端，定位于膜上，而其亲水部分插入F1中，c亚基有两个疏水部分，可以跨越整个膜，所有亚基形成一个环状结构，每个亚基含有一个离子键和位点，可以键合一个质子。图3 ATP合酶的结构模型关于ATP合酶的催化作用机理，1964，Boyer 首先提出三点顺序结合变化机制3: 除此之外，为了满足“结合变化机理”所提出的三个b亚基不断交替呈现不同构象的要求，Boyer 又提出旋转催化的设想，他认为跨膜质子梯度驱动ATP合酶的F0的c亚基转动，继而带动F1的g亚基而使3个b亚基构象发生交替变化来合成ATP。Boyer的假说虽然在当时就已经受到了很多间接实验证据的支持，但它的真正得到承认，是在1994年Walker小组发表了F1的晶体结构之后4。1994，Walker通过对F1-ATP 酶的晶体结构分析（图4），清晰显示F1-ATP酶在ATP水解过程中3个b亚基的构象明显不同：一个是结合ATP即将键裂的tight状态，一个是ADP即将释放的Loose状态，一个是无底物结合放入Open状态。他们的结果有力支持了Boyer的假说，因此共享了1997年诺贝尔化学奖。图4 F1-ATP 酶水解过程的晶体结构分析但是对Boyer的旋转催化机理最有力的支持还是日本的Yoshid小组5，他们设计实验直接观察到了g亚基的顺时针转动（图5）。图4 F1-ATP 酶水解过程的晶体结构分析1994，Walker通过对F1-ATP 酶的晶体结构分析（图4），清晰显示F1-ATP酶在ATP水解过程中3个b亚基的构象明显不同：一个是结合ATP即将键裂的tight状态，一个是ADP即将释放的Loose状态，一个是无底物结合放入Open状态。他们的结果有力支持了Boyer的假说，因此共享了1997年诺贝尔化学奖。但是对Boyer的旋转催化机理最有力的支持还是日本的Yoshid小组5，他们设计实验直接观察到了g亚基的顺时针转动（图5）。图5，g亚基的转动实验不仅g亚基的转动被证实，人们还发现g亚基的旋转呈阶梯状，120一个周期性6,7,8,9。因ATP合成以及水解是完全可逆的过程，所以以ATP的水解为例说明，三种颜色表示三个不同的催化活性位。以红色表示的活性位为例，前240，完成ATP键合，以及对ATP的水解，并准备释放ADP，释放ADP驱动g亚基再转动80，最后释放Pi驱动g亚基转动40，刚好转动360，实现一分子ATP的水解。图6 ATP水解过程中g亚基的转动是什么力驱动F1转动的呢？现在一般认为是质子梯度通过F0产生力矩驱动F1转动10。F0中c亚基环的移动受两种静电约束的控制：红色位点带酸残基，显负电性，结合带正电的定子，蓝色位点表示质子化后的酸性残基，呈电中性，结合疏水性的脂膜，当一个质子从膜的下面通道进入，键合一个酸性残基，该位点与定子之间的静电约束被解除，F0环就逆时针转动一步，膜上端的另一个质子从键合位点解离，进入上面的质子通道，并释放出一个酸性的键合位，该酸性位点继续键合膜下面通道输送的质子，就实现了F0环的转动。 图7 旋转马达Fo的旋转结构模型。ATP合酶，包含两个纳米马达：离子驱动的F0和化学活性的F1，这两部分通过一个中心转子和一个偏心的轴承偶联起来，两个马达的转动，F1包含3步，而F0包含10-15步，如何才能实现高的偶合转动速率呢？统计力学的模拟发现一个弹性力传动是需要的，通过对F0F1的刚性柔性区域分布进行研究，发现某些区域的刚性受转子和定子之间的二硫键控制，未收控区域的抗扭刚度通过分析热力学旋转波动确定11。将一个荧光标记的磁性小球连到F1分子上，一个荧光标记的肌动蛋白微丝连到F0F1上，用它们做探针分子来表征F1的转动。大部分酶，尤其是F1的中心轴，和长的轴承相当刚性，g亚基和e亚基的球形部分和F0的c环的接触处，柔性很大。这种弹性缓冲器可部分消除两者差异,使其更好协调。图8 旋转机械效率的测定图8 旋转机械效率的测定在应用方面，美国的科学家利用F1-ATP酶作为分子旋转马达研制出一种“纳米直升机”12，它是由F1-ATP酶的部分亚基，金属纳米推动器，Ni纳米支柱三部分组成的纳米机电装置，纳米推动器的转动由三磷酸腺苷（ATP）激发而由叠氮化钠抑制。这样的装置在医药方面很可能会有重要的应用价值。图9 F1-ATP酶组装的“纳米直升机”ATP合酶是一种结合电学、力学、化学等各方面酶功能的分子机器，有关其能量转换的分子机理研究正在不断深化，是当前分子生物学，生物物理学，生物化学、生物能力学、生物工程学的研究热点之一。由于微型马达在军工、航天、工业、医药等方面都有广泛需求，因此对ATP合酶这个最小转动马达的模仿无疑会有重大的应用价值。 但总体来说，这方面的研究尚处于初步阶段，无论是实验还是理论方面，在分子水平上理解ATP合酶还需要很多努力：分子柔性和结构的复杂性使高分辨的F0F1-ATP合酶的完整晶体结构很难得到，ADP合成ATP的各部反应的完整的动力学和力学表征还没完成，有关F0上质子迁移机理的详细研究还需深入研究，结构理论预测和热力学、动力学观察之间的矛盾（质子：ATP比例，实验观察是4，但是理论预测应是4.5）还有待解释。参考文献：1.王镜岩 生物化学 第三版2.Mitchell, P. Nature 191,144 (1961) 3.Boyer, P. D., Cross, R. L. Proc. Natl Acad. Sci. USA 70,2837(1973)4.Abrahams, J. P. et al ,Nature 370,621(1994)5. Noji H., et al., Nature 386, 299 (1997)6. Yasuda, R. et al. Cell 93,1117(1998) 7. Yasuda, P. et al. Nature 410,898(2001) 8. Adachi, K. et al. cell 130,309(2007)9. Sielaff, R. et al. Biophys.J.95,4979(2008)10.