分子生物学2013后四章.doc

分子生物学 总复习 2020/1/8 第五章 蛋白质的生物合成1. 原核mRNA序列特征：5端具有两个翻译起始保守序列。起始密码子，一般为AUG；核糖体结合位点（SD序列）：位于起始密码子上游914个核苷酸，共同序列与16S rRNA 3端序列反向互补，使结合于30S亚基的起始tRNA正确定位于起始密码子AUG；多顺反子。多顺反子中各基因独立起始翻译（有独立的SD序列）；基因间隔长度与核糖体的装配有关，间隔过长会导致核糖体解聚，并起始新的组装；多顺反子中SD序列对基因表达效率起关键作用。真核mRNA序列特征：5帽子结构可增强翻译效率；没有SD序列，但起始AUG旁侧区域与翻译相关：AUG上游的-3经常是嘌呤，常常是A；紧跟AUG的-4常常是G；起始序列以ANNAUGGN（Kozak序列）利用率为高，若-3不是A，则+4的G对于有效翻译起始作用必需；5端非翻译区若形成发夹结构会对翻译起始起顺式阻碍作用，是一种翻译活性的调控方式；先导序列的长度会影响翻译的起始效率和准确性；帽子结构与AUG间的距离太短，就不能利用此AUG起始翻译。2. 遗传密码（genetic codon)：mRNA分子上从5至3方向，由AUG开始，每三个相邻的核苷酸为一组,在蛋白质合成中代表某种氨基酸或其他信息,称为密码子或三联体密码,统称为遗传密码。终止密码子：UAA、UAG、UGA 初始密码子（编码Met）：AUG UGG: Trp 色氨酸遗传密码的特点：1）连续性组成遗传密码的三联体没有间断，须3个一组连续读下去，直至出现终止密码子为止。移码突变：mRNA链上碱基的插入或缺失，就会改变密码阅读的顺序，造成框移，使下游翻译出的氨基酸完全改变2）简并性一种氨基酸可有几个意义相同的密码子，即同义密码子。一般同义密码子之间，前两个碱基均相同，只是第三个碱基不同。3）摆动性摆动假说：反密码子和密码子配对时，有时会出现不遵从碱基配对规律的情况，称为遗传密码的摆动现象。这一现象常见于反密码子的第一位碱基与密码子的第三位碱基之间。摆动假说也称为三中读二。4）通用性生物体之间有通用性，线粒体和叶绿体使用的遗传密码稍有差别。开放读码框架（ORF）：mRNA分子中含有密码子信息的区域，5端为起始密码子，3端为终止密码子。3. 原核生物翻译过程中核糖体活性位点:三个（A位：氨基酰位(aminoacyl site)P位：肽酰位(peptidyl site)E位：排出位(exit site)）1 在多肽键结合前，肽酰tRNA在p位点，氨酰tRNA在A位点，但P位点能够与起始tRNA 结合（fMet-tRNA)。2 多肽键形成时，包含转移多肽从P位的肽酰到A位的氨酰tRNA。3 转移：移动核糖体一个密码子，定位肽酰tRNA回归P位点，脱酰tRNA通过E位点离开；A位点变空为下一个aaRNA准备。两个位点具有不同的特征。 一，第一个进入的氨酰tRNA结合至A位点。在氨酰tRNA进入之前。位点露出预定要加到链上的代表下一个氨基酸的密码子。二，代表最新加入新生肽链的密码子，位于P位点Psite（或供体位点）。这个位点，被肽酰tRNAPeptiotyltRNA，即携带新生肽的tRNA所占据。 携带一个氨基酸的tRNA的末端位于大亚单位上，而另一端的反密码子则同被小亚单位结合的mRNA相互作用。因此，P和A位点必须延伸跨越两个核糖体亚单位。 当肽酰tRNA位于P位点，而氨酰tRNA位于A位点时，对于一个合成肽键的核糖体而言，当肽酰tRNA携带的多肽，被转移至氨酰tRNA所携带的氨基酸时，肽键就会形成。这一反应由核糖体大亚单位的组份催化。 tRNA的移动顺序为A-P-E4.16S rRNA：16S rRNA与大小亚基的组装和解离密切相关。 在蛋白质合成中16sRNA起主要作用； 16S rRNA的3末端与mRNA起始密码子上游序列反向互补直接作用；16S rRNA在核糖体的A位和P位与tRNA中的反密码子直接作用；23S rRNA：具有肽基转移酶活性。 23S rRNA在核糖体的P位和A位与肽酰tRNA的CCA末端相互作用；5. 核糖体的翻译结构域的位点：mRNA结合位点:位于小亚基头部，负责与mRNA的初始结合以及与起始tRNA的结合，也是起始因子IF3的 结合位点；P位点。肽酰tRNA位点，大部位于大亚基，包含16S rRNA的3端；能与起始tRNA结合；A位点。氨酰tRNA位点，紧靠P位，主要位于小亚基，16S rRNA是其构成成分；A位能结合氨基酰tRNA，活性受P位影响；E位点。靠近P位，从P位点离开已脱去肽酰基的tRNA在释放到胞质中之前在该位点短暂停留；肽基转移酶活性位点:在50S亚基，靠近tRNA的受体臂；G因子结合位点。能水解GTP，位于大亚基基部，靠近小亚基的界面处，是所有的G因子的结合位点；5S rRNA位点。在50S亚基上，靠近肽基转移酶位点，与tRNA的进入有关。核糖体的多肽离去结构域：与膜结构结合；多肽链从肽酰转移酶活性位点离开，经离去通道，转移到50S核糖体亚基表面；多肽链的折叠始于其离开核糖体后。6. tRNA和氨基酰tRNA翻译中tRNA作用：tRNA在翻译过程中起接合体（adaptor）作用，又是氨基酸的运载体。氨基酸的活化由特异的氨基酰-tRNA合成酶（amino acyl-tRNA synthe-tase，aaRS）催化,有两类。aaRS的特征：绝对专一性和校正活性aaRS的高度特异性体现于对氨基酸有严格的特异性，而对与此氨基酸相适应的数种同工tRNA则无严格的特异性。7.原核生物蛋白质合成起始因子：促成mRNA、起始tRNA和核糖体大小亚基装配，形成起始复合体。IFGTP结合能力生物学活性与功能IF3有形成三元复合物；解离因子活性，使70S核糖体颗粒解离为30S和50S亚基IF2有与起始tRNA结合并控制其进入30S小亚基,形成30S前起始复合物IF1无无特异功能，但具有加强 IF2和IF3的活性和促进起始复合物稳定性的作用。延伸因子作用：均具有GTPase活性 EF-Tu ：按照mRNA序列将AA-tRNA带入大亚基A位； EF-Ts：促使EF-Tu恢复活性状态； EF-G：负责肽酰-tRNA从A位向P位转移；终止因子作用：识别终止密码子，终止肽链合成并释放核糖体8.原核生物蛋白质的合成基本过程-次序比较重要，与真核生物过程上的区别1）肽链合成的起始-三元复合物（trimer complex）的形成 IF-3结合30S小亚基，再与mRNA SD序列结合形成IF3-30S亚基-mRNA三元复合物。2）30S前起始复合物的形成在IF2作用下，甲酰甲硫氨酸-起始型tRNA与起始密码子结合；IF3从三元复合物脱落，形成30S前起始复合物。3）70S起始复合物形成50S亚基与30S前起始复合物结合，同时IF2脱落，形成70S起始复合物真核生物翻译起始 形成mRNA复合物（帽结合蛋白eIF-4E（CBP2）+mRNA帽子，再与eIF-4G、eIF-4A、eIF4B相互作用）；形成eIF2-GTP-Met-tRNAiMet三元复合体（起始因子eIF-2-GTP+Met-tRNAiMet组成）；形成43S核糖体复合物（eIF-3、eIF-4C与40S小亚基结合）；形成43S前起始复合物（43S核糖体复合物与三元复合体）；eIF-2以eIF2-GDP形式释放形成48S前起始复合物；40S核糖体小亚基延mRNA移动至AUG密码子；形成80S起始复合物；9. 蛋白质生物合成起始中的几个问题（填空或者判断）蛋白质的合成起始是由核糖体游离亚基执行的；IF3与30S小亚基结合可阻止核糖体大小亚基间的结合；肽链起始需要特殊的起始tRNA： 甲硫氨酸是所有蛋白质合成的起始氨基酸；携带Met的tRNA有两种，一种用于起始，另一种用于延伸起始tRNA携带的甲硫氨酸是氨基基团甲酰化的，即tRNAfMet ；10.肽链合成的延伸 进位延伸的氨酰基-tRNA进入A位转肽与肽键形成转位11.肽链合成的终止两个阶段1）肽链释放释放因子RF1和RF2 作用于A位并识别终止密码子，激活肽基转移酶，将肽基转移到水分子上；在RF3的作用下RF1和RF2从核糖体释放。2）tRNA、mRNA释放与核糖体解离总结：氨基酸活化：2个PATP起始： 1个GTP延长： 2个GTP终止： 1个GTP每合成一个肽键至少消耗4个P。12.真核生物翻译起始机制扫描模型mRNA5端的甲基化帽子及核糖体结合位点为寻找起始密码子提供了基础；40S亚基首先与帽子位点结合；然后沿mRNA移动至其结合位点。13. 真核生物翻译起始的特点1）起始型tRNA为Met-tRNAiMet，N末端未甲酰化。2）Met-tRNAiMet和GTP、eIF2形成一个可分离的复合物，不依赖于小亚基。而原核IF2与Met-tRNAMet结合在30S小亚基上。3）Met-tRNAiMet与40S小亚基结合先于与mRNA结合，而原核mRNA与30S小亚基的结合在先。4）ATP水解提供能量，是mRNA结合必需的。5）真核eIF种类多，且许多eIF本身是多亚基的。6）mRNA 5端帽子是起始必需的。7）真核起始因子eIF-2存在一种可循环的蛋白质合成调节方式。第六章 基因表达调控1.基因表达（gene expression）：在特定调节机制控制下，基因经过转录及翻译，产生具有特异生物学功能的蛋白质分子的过程。对于原核生物，以营养状况和环境因素为主要的基因表达影响因素。2. 负调控系统：调节蛋白为阻遏蛋白 基因表达 调节蛋白 基因表达关闭。正控制系统：调节蛋白为诱导蛋白 基因关闭 调节蛋白 基因表达开启。3.基因表达的4种控制模式：可诱导负调控：阻遏蛋白不与效应物（诱导物）结合时，结构基因不转录；可阻遏负调控：无活性的阻遏蛋白与效应物（辅阻遏物）结合时，结构基因不转录。阻遏蛋白作用于操纵区。可诱导正调控：效应物分子（诱导物）的存在使无活性的激活蛋白处于活性状态；可阻遏正调控：效应物分子（辅阻遏物）的存在使激活蛋白处于非活性状态。4.基因表达的一般特性：1）时间特异性按功能需要，某一特定基因的表达严格按特定的时间顺序发生。多细胞生物基因表达表现为与分化、发育阶段一致的时间性，因此又称阶段特异性。2) 空间特异性在个体生长全过程，某种基因产物在个体按不同组织空间顺序出现。这种空间分布差异，实际上是由细胞或器官的分布决定的，因此又称为细胞或组织特异性。 5. 管家基因 (house-keeping gene)：某些基因在一个生物体几乎所有细胞中持续表达，其产物在细胞里总是存在的基因。如E. coli中葡萄糖代谢酶基因。6. 操纵子(operon)：通常由2个以上的编码序列与启动序列、操纵序列以及其他调节序列，在基因组中成簇串联，组成一个转录单位。操纵序列（operator）：阻遏蛋白的结合位点。反式作用因子（trans-acting factor）：绝大多数真核转录调节因子由某一基因表达后，通过与特异的顺式作用元件相互作用，影响另一基因的转录。顺式作用蛋白：可特异识别、结合自身基因的调节序列，调节自身基因的开启或关闭。顺式作用元件（cis-acting element）（真核）：指可影响自身基因表达活性的特异DNA序列。通常是非编码序列。包括启动子、增强子及沉默子等。7. DNA蛋白质、蛋白质蛋白质互作DNA蛋白质相互作用特异识别非共价结合DNA结合位点常呈对称结构蛋白质蛋白质相互作用-形成二聚体或多聚体，间接结合DNA启动子与调节蛋白影响其与RNA聚合酶的亲和力从而改变基础转录频率8.转录调节的特点操纵子模型具有普遍性（真核生物无）阻遏蛋白与阻遏机制具有普遍性（真核生物普遍存在正调控）ss因子决定RNA聚合酶识别特异性9. 乳糖（Lac）操纵子的调控-重点！（一）结构及其功能基因Z：b-半乳糖苷酶基因，分解乳糖为半乳糖和葡萄糖；基因Y：乳糖透性酶基因，增加细胞壁透性，有助于乳糖进入；基因A：半乳糖苷乙酰转移酶基因，催化乙酰基从乙酰辅酶A到半乳糖；操纵基因O：转录起点位置，调节基因产生的阻遏物附着处；启动子P：RNA聚合酶聚集的地方；CAP位点：激活蛋白结合位点，激活蛋白通过cAMP对葡萄糖作出反应；调节基因I：编码阻遏蛋白或激活蛋白。（二）调控机制1）负调控可诱导的负调控乳糖缺乏时，阻遏物封闭操纵序列，RNA聚合酶不能达到转录起点，转录停止；当存在诱导物乳糖时，乳糖进入细胞中，与阻遏物结合并使其失活，阻遏物脱离操纵子；RNA聚合酶达到转录起点，转录过程开始，并翻译生成与乳糖代谢有关的3种酶。（2）正调控。CAP是一类正调控因子，结合于很多启动子，是控制营养代谢有关的操纵子的激活蛋白；CAP蛋白与cAMP形成复合物后才能结合于CAP结合位点激活Lac操纵子。2）正调控cAMP这个第二信使是受葡萄糖代谢抑制的所有操纵子的正调控物，cAMP的浓度与葡萄糖浓度呈反比； CAP蛋白与cAMP形成复合物后才能结合于CAP结合位点激活Lac 操纵子。环境中无葡萄糖可供利用时，cAMP含量高，促进转录起始；当利用葡萄糖分解产生能量时， cAMP含量低，抑制转录起始；E. coli 的乳糖启动子有两个CAP结合位点，当cAMP-CAP复合物结合于位点I，位点II结合复合物的能力显著提高；3）大肠杆菌利用碳源的协调调节：由于单纯因乳糖的存在发生去阻遏使lac操纵元转录开放，还不能使细菌很好利用乳糖，必需同时有CAP来加强转录活性，细菌才能合成足够的酶来利用乳糖。lac操纵元的强诱导既需要有乳糖的存在又需要没有葡萄糖可供利用。10.色氨酸（trp）操纵子的调控：（1）Trp操纵子可阻遏负调控系统粗调控：色氨酸作为辅阻遏物活化特异性阻遏蛋白并结合形成复合体，附着在trpO上将trp操纵子的转录封闭；（1）操纵子的衰减子调控细调控：决定启动的转录是否能进行下去。11.Trp操纵子可阻遏负调控系统-典型的负调控1）粗调控两个位点控制色氨酸合成：1）操纵基因trpO，是阻遏蛋白附着处；2）调节基因trpR, 编码阻遏蛋白；色氨酸作为辅阻遏物(corepressor)活化特异性阻遏蛋白并结合形成复合体，附着在trpO上将trp操纵子的转录封闭。2）细调控转录衰减（attenuation）：转录可正常起动，但进入第一个结构基因前即突然停止的过程。由于此作用并不能使正在进行的结构基因转录中途停止，而仅是部分中途停止转录，所以称为转录衰减。衰减子（attenuator）：操纵子前导区内类似终止子结构的一段DNA序列。作用是减弱操纵子的转录。前导序列组成：启动子操纵基因前导肽编码序列弱化子序列弱化子终点1）前导序列组成：启动子操纵基因前导肽编码序列弱化子序列弱化子终点2）前导序列的特点：前导序列部分区段富含GC，易形成发夹结构；末端8个U构成不依赖于r因子的终止信号，能使mRNA合成提前终止；前导肽由14个氨基酸组成，前面是5个核糖体的强结合位点，编码序列中有一终止密码子UGA；前导序列中并列两个色氨酸密码子。3）前导序列二级结构与弱化子构象trp mRNA前导序列有4段区域存在互补关系：1-2区、2-3区、3-4区间都可进行局部氢键配对1-2区，3-4区配对，构成不依赖于r因子的终止信号，这种结构称为trp操纵子弱化子，将造成转录提前终止；2-3区配对转录可继续进行。4）弱化作用的机理弱化作用实际上是以翻译进程控制基因的转录进程；前导序列RNA两种构象的转换取决于前导肽mRNA翻译过程中trp-tRNA可得到的情况；当trp存在时，核糖体能够合成前导肽，核糖体将一直前进到1-2区间的终止密码子UGA，此时的核糖体伸展到2区，结果阻碍2-3区配对，会形成3-4配对，产生终止结构，RNA转录在弱化子处终止；当trp不存在，核糖体在1区的trp密码子处停顿，1区处于核糖体覆盖下，不能与2区配对，2-3区配对形成，迫使4区处于单链状态，不形成二级结构的终止信号，RNA聚合酶就穿过弱化子区继续转录。举例说明原核生物基因转录的衰减子调控系统。（07年考题）衰减子：操纵子前导区内类似于终止子结构的一段DNA序列，称为衰减子。其作用是减弱操纵子的转录。以色氨酸操纵子为例前导序列的特点：前导序列部分区段富含GC，易形成发夹结构；末端8个U构成不依赖于r因子的终止信号，能使mRNA合成提前终止；前导肽编码序列编码了一段14个氨基酸的前导肽，其前面是5个核糖体的强结合位点，编码序列中有一终止密码子UGA；前导序列中并列两个色氨酸密码子。前导序列的二级结构，trp mRNA前导序列中有4段区域存在某种互补关系：1-2区、2-3区、3-4区间都可进行局部氢键配对；1-2区，3-4区配对，构成不依赖于r因子的终止信号，这种结构称为trp操纵子弱化子，将造成转录提前终止；2-3区配对转录可继续进行。当trp存在时，核糖体能够合成前导肽，核糖体将一直前进到1-2区间的终止密码子UGA，此时的核糖体伸展到2区，结果阻碍2-3区配对，会形成3-4配对，产生终止结构，RNA转录在弱化子处终止；当trp不存在，核糖体在1区的trp密码子处停顿，1区处于核糖体覆盖下，不能与2区配对，2-3区配对形成，迫使4区处于单链状态，不形成二级结构的终止信号，RNA聚合酶就穿过弱化子区继续转录。12. 原核基因时序调控的三种形式：RNA聚合酶原s因子被新因子替代，识别新启动子（E.coli通过s因子的替换来响应环境的变化）合成新的RNA聚合酶，开启新的启动子（T7通过RNA聚合酶控制时序表达）；合成新的调控因子，影响RNA聚合酶转录终止信号（l噬菌体通过新蛋白质因子调节时序表达）。小点：Cro是决定l噬菌体溶源或裂解的关键蛋白；蛋白质的自我调控：1. T4噬菌体p32蛋白质合成 2.核糖体蛋白质合成的自我调控 3、终止因子RF2翻译的自身调节13. 反义RNA(mRNA干扰互补RNA，micRNA)：原核生物中普遍存在的，独立合成的小单链RNA分子，其特殊碱基序列可与互补的“靶” mRNA形成双链结构，并抑制“靶”mRNA翻译，是一种反式作用调控因子；14. 真核细胞基因表达的7个可调控位点(小知识点)：染色体和染色质水平的活化；转录水平上的调控，包括基因的开闭，转录活性水平的高低；RNA加工水平上的调控，对初始转录产物的活化、修饰、选择性剪接等；转录后加工产物，如mRNA从细胞核向细胞质转运过程受到的控制；翻译的控制，选择哪种mRNA给核糖体翻译，包括翻译量的控制；蛋白合成后选择性地被激活或失活，蛋白质水平上的剪切、活性水平的控制；控制mRNA的选择性降解是基因表达调控的另一重要方面。15. 染色体水平的调控形式：基因丢失（马蛔虫）、基因扩增（非洲爪蟾rRNA）、染色体重排（酵母接合型转换沉默盒和活性盒转换、免疫球蛋白）。免疫球蛋白重链和轻链均可变化，在V区可变，重链基因的类别转换主要是C基因发生重排16.高敏感性位点（preferential sensitivity）一般位于基因上游1kbp范围内，长度限于100200bp，是转录起始有关蛋白质因子与启动子识别、结合的序列；该位点序列可与其它蛋白质结合，阻止组蛋白的结合，从而不形成通常的核小体结构；高敏感点与基因表达有关，高敏感性的出现意味着基因更接近可转录状态。超敏感性位点（hypersensitive sites）超敏感位点与整个基因簇的活化有关，而高敏感位点仅仅同基因簇中某个基因活化转录相关；高敏感位点紧靠活化基因，主要在启动子范围内；而超敏感位点远离基因，而且5和3端成对出现，在超敏感性位点的界限之内是潜在的可活化基因。17.染色质重建：组蛋白修饰-甲基化降低转录活性，磷酸化增强活性18. DNA水平上的调控（一）DNA的甲基化-胞嘧啶甲基化（m5C）是真核生物DNA的特点甲基化与基因活性调节有关：甲基化程度高，基因转录活性低；而甲基化程度低，基因转录活性高。因此活跃基因状态称做甲基化不足(under-methylation)。启动子去甲基化，即基因5侧翼区的胞嘧啶甲基化范围变小可能使该区域成为转录的起始；另一种可能是降低甲基化程度是进行转录所需要某种结构的需要。(二)CpG岛：基因组中稳定成簇的非甲基化GC小片段19.真核生物rRNA实现高效转录的机制专一性RNA聚合酶的使用避免了其它基因启动子的竞争；rDNA串联重复并高度集中增加了启动子的局部浓度；rDNA串联重复使RNA聚合酶I不必解离；NTS序列中的多拷贝启动子能够吸引更多的RNA聚合酶I。20.转录调节因子结构域：（1）DNA结合域（DNA binding domain）(直接与DNA结合的才有此种结构域)：螺旋-转角-螺旋；锌指；亮氨酸拉链；碱性a-螺旋b-折叠；螺旋环螺旋。（2）转录激活域（activating domain）：富含酸性氨基酸结构域；富含谷氨酰胺结构域；富含脯氨酸结构域。（3）蛋白质蛋白质结合域（二聚化结构域）。第七章 基因重组1. 分子内或染色体内重组：指由于不同DNA链的剪切和连接而产生DNA片段的交换和重新组合形成新的DNA分子的过程。2. 分子内重组类型区别（大肠杆菌）类型同源序列RecA蛋白序列特异性酶同源重组需要需要不需要位点特异性重组不需要需特定短序列不需要需要转座重组不需要不需要需要异常重组不需要不需要？3. Holliday重组模型：联会：同源双链配对；切刻：联会两分子中各发生一个单链断裂；链交换：断裂单链进行重新碱基配对交换，切口封闭形成Holliday中间体；分支迁移：Holliday中间体交叉点移位；Holliday中间体旋转变构；Holliday中间体产生二次切刻；切刻封闭产生重组分子。4. RecA蛋白：又称重组酶，是同源重组最重要的蛋白，主要功能是促进DNA分子同源联会和DNA分子间的单链交换RecBCD酶：由recB、recC、recD基因编码；结合在双螺旋游离端，起始其解旋作用，利用ATP的能量沿双螺旋前进，经过处DNA解旋又复旋；将靠近Chi处的单链切断，促进Chi位点上的重组作用。Chi是重组频率较高的部位。5. 位点特异性重组-l噬菌体的整合位点特征1）整合过程Int与IHF与att位点结合；attP及attB配对； att位点共同顺序内准确断裂、重组，重新连接 ；整合后在两旁形成两个重组att位点BOP及POB，即attL及attR。2）切除反应切离识别的是attL和attR；切除的酶类与整合不同；3）位点特异性重组有方向性第八章 DNA损伤与修复（小知识点）1. DNA损伤：DNA由于自发或外源物理、化学因素作用下发生物理或化学结构的改变。2. DNA分子的自发性损伤：（一）DNA的自发性化学变化烯醇式与酮式碱基间的异构互变结构酮式碱基烯醇式碱基配对原则A-T；G-CA-C；G