酵母蔗糖酶提取方法的研究.doc

酵母蔗糖酶提取方法的研究生命科学学院 10级生物科学类 李倩 10197022指导老师：陶芳摘要：采用自溶法从酵母中提取蔗糖酶，通过抽提、30乙醇分级、50乙醇分级和透析，同时测定各步的蛋白质浓度和酶活，并据此计算比活、回收率和纯化倍数。关键词：蔗糖酶 提取 自溶法 Research on the Extraction Method of Yeast SucroseSchool of Life Sciences， Biological Sciences of grade 2,li Qian, 10197022Abstract:The autolysis extract from yeast invertase,through extraction,30 ethanol fractionation and dialysis,simultaneous determination of each step of concertration of protein and enzyme avtivity,and then calculate the radio of live,recovery and purification. Key words:yeast；extraction；autolysis method前言：蔗糖酶（Sucrase,EC 3.2.1.26)又称转化酶（Invertase),1928年Dumas等首先指出酵母菌发酵蔗糖时必须有这种酶的存在，蔗糖在蔗糖酶的作用下，水解为葡萄糖和果糖，还原力增加，又由于生成果糖，甜度增加。按水解蔗糖的方式，蔗糖酶可分为从果糖末端切开蔗糖的-D-呋喃果糖苷酶（-D-frutofuranosidases,EC 3.2.1.26)和从葡萄糖末端切开蔗糖的-D-葡萄糖苷酶（-D-glucosidases,EC 3.2.1.20)。前者存在于酵母中，后者存在于霉菌中。工业上多从酵母中提取。蔗糖酶在工业上用以转化蔗糖，增加甜味，制造人造蜂蜜，防止高浓度糖浆中的蔗糖析出，还用来制造含果糖和巧克力的软心糖等。本实验目的在于用自溶法提取酵母蔗糖酶的过程中，测定各步的总蛋白、总活力，并据此计算比活、回收率和纯化倍数。1. 材料与方法 1.1 材料与仪器 1.1.1 材料 酵母粉（市售）。 1.1.2 仪器 离心机；722分光光度计；水浴锅等。 1.1.3 试剂 牛血清蛋白；3，5-二硝基水杨酸试剂；考马斯亮蓝G-250；磷酸缓冲液（0.005mol/L pH6.0)等。1.2 方法 1.2.1 蔗糖酶粗品的制备 将5g酵母粉倒入500ml烧杯中、少量多次地加入15ml蒸馏水，搅拌均匀，成糊状后加入0.5g乙酸钠、8ml乙酸乙酯，搅匀，再于35恒温水浴中搅拌30min。补加10ml蒸馏水后，搅匀盖严，35恒温过夜后，4000r/min离心10min,得到的上清液即为粗制酶液。 1.2.2 葡萄糖标准曲线的制作 在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度成一定比例关系，可用于比色测定。采用DNS比色法测定还原糖的含量，同时可测定酶活。取葡萄糖标准品，用缓冲液配置成一定梯度浓度的溶液，与DNS显色后在520nm测定吸光值。表1 葡萄糖浓度标准曲线的制作项目空白123456含糖总量mg00.81.21.62.02.42.8葡萄糖液ml00.40.60.81.01.21.4蒸馏水ml2.01.61.41.21.00.80.6DNS试剂ml3333333加热均在沸水浴中加热5min冷却立即用流动冷水冷却蒸馏水ml20202020202020光密度OD520nm以葡萄糖含量（mg)为横坐标、吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，获得的葡萄糖标准曲线回归方程为：y=0.0746x+0.0024。 1.2.3 蛋白质标准曲线的制定 采用考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质浓度。取标准牛血清蛋白，用生理盐水配置一定梯度浓度的系列标准蛋白液，与G-250作用后在595nm测定吸光值。表2 蛋白质定量测定标准曲线制作溶液0管1管2管3管4管5管留样1留样1系列标准蛋白液ml_0.20.40.60.81.00.50.5实际蛋白质含量g_20406080100_0.9%生理盐水ml1.00.80.60.40.2_蛋白质染色液ml5.05.05.05.05.05.05.05.0 轻轻摇匀，5min后以0号管调空白，595nm分光光度法测光密度值，汇出标准曲线。未知样品从标准曲线上查出相应浓度经测定，得表3 蛋白质含量与光密度值测定结果试管号 0 1 2 3 4 5 实际蛋白质含量（mg) _ 20 40 60 80 100 OD(595) 0 0.142 0.355 0.455 0.654 0.787 以蛋白质含量（mg)为横坐标、吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。获得的蛋白质曲线方程为：y=7.945x+0.0019。从上述公式可知，吸光值和蛋白质含量呈正相关。 1.2.4蛋白质浓度测定 从留样中取0.3ml加0.9%的Nacl 稀释至3ml,再按以下表格操作测定表4 蛋白质浓度OD值 溶液 对照组 留样系列标准蛋白液/ml 0.5 0.9%生理盐水/ml 1.0 0.5 蛋白质染色液/ml 5.0 5.0 1.2.5 蔗糖酶活的测定 取5%的蔗糖、酶液5ml分别于35水浴中预热5min若酶浓度过高，用0.02mol/l的醋酸缓冲液（PH=4.7）适当稀释。表6蔗糖酶水解蔗糖试管 0 1 5%蔗糖 2 2 1mol/lNAOH(ml) 0.5 酶液（ml） 2 2 35水浴，3min 1mol/lNAOH(ml) 0.5 表7还原糖的测定试管 0 1 2 反应液(ml) 0.5 0.5 0.5 (取自表1中0管) (取自表1中1管) (取自表1中1管) DNS试剂(ml) 3 3 3水(ml) 1.5 1.5 1.5 沸水浴5min后，立即流水冷却 水(ml) 20 20 20 OD(520) 在该条件下，每3ml释放1毫克还原糖所需的酶量，定义为一个活力单位。 1.2.5 粗酶的乙醇分级分离和透析先测定所提粗酶液的pH,用10%的HAC调pH至4.5（注意少量、慢加、搅匀，防止调过。），共加入约0.6ml的HAC。调好pH的粗酶液在不断搅拌下缓慢滴加6.7ml无水乙醇，使其质量分数达30%，4000r/min离心10min,取上清液，留样2ml。剩余上清液追加无水乙醇使其质量分数达50%，4000r/min离心10min,沉淀立刻用10ml 1/150mol/L pH6.0的磷酸buffer溶解，并装入透析袋过夜。次日，将透析液4000r/min离心10min,取上清液。 1.2.6 计算公式 酶活力单位=G毫克数915/2酶活（u/ml)=酶活力单位u0.1ml 蛋白质浓度（mg/L）=x mg30.510.32. 结果与分析 2.1 蛋白质测定结果基本数据表8蛋白质含量测定表试管OD595 E1 E2 E3 1 0.707 0.251 0.077 2 0.675 0.305 0.061 平均 0.691 0.278 0.069 2.2 酶活测定基本数据表9 酶活测定表试管OD520E1 E2 E3 1 0.518 0.099 0.059 2 0.565 0.152 0.043 平均 0.5415 0.1255 0.051 2.3 蔗糖酶分离提取效果计算结果从表3中结果可看出，留样1、2、3中的蛋白质浓度和总蛋白含量逐渐减小，蔗糖酶活、总活力和比活力也逐渐降低，每一步的纯化倍数和产量也是逐渐降低的。表10 蔗糖酶分离提取效果计算表留样体积/ml蛋白质浓度mg/ml总蛋白mg活力u/ml总活力u比活力u/mg纯化倍数产量（回收率）116.51.73428.615420.258.941053.121051100219.50.69613.571485.092.901052.141050.68632.43110.171.87586.356.451043.451040.11122.23. 讨论 3.1 酵母蔗糖酶提取的其他方法与比较 酵母蔗糖酶的提取较常使用甲苯自溶法，除此还有冻融法和SDS抽提法，但报道较少。而且，SDS抽提法和冻融法的酶活性远高于甲苯自溶法的。3.2 讨论 本实验先采用自溶法得到蔗糖酶的粗品，再通过测定蔗糖酶活力、还原糖含量、蛋白质含量计算出蔗糖酶提取效果（比活、回收率、纯化倍数）。该实验只能进行粗测定，且本实验对于温度的控制要求比较高。该实验不仅需要花费大量的时间进行现象观察、数据处理，而且在试验中步骤繁琐，重复性实验步骤较多，因此加大了人为因素对实验结果的影响，步骤的繁琐也加大了操作过程中误差出现的频率。所以实验结果跟理论结果相比差异会比较大。 在测定酶活的过程中，可能是由于本组提取的蔗糖粗酶液的浓度过高，导致对照管中滴加0.5ml 1mol/l的NAOH不足以使反应中止，是的酶液与蔗糖反应，测得OD值较小。我们采取改进措施：在留样1的酶活测定中，加了1ml 1mol/l的NAOH,同时扩大反应液的稀释倍数，酶活力单位计算公式调整为：G毫克数1015/2；留样2、3测定中，将酶液稀释了200倍，其余步骤不变，酶活力单位计算公式调整为：G毫克数920/2。 在测定样品的OD值时，电子读数不稳定，可能是样品溶液中各个部分不均匀。所以在用实验操作过程中，提取酵母蔗糖酶时一定要搅拌均匀。4. 建议和改善4.1 自溶法过程中，需加少量防腐剂，以防外界细菌污染。自溶法的缺点是时间较长。可采用其他方法进行。酶的分离纯化有许多种方法，离心、过滤、膜分离、演习沉淀、等电点沉淀、选择性变性沉淀、离子交换层析、凝胶层析、亲和层析、凝胶电泳、有机溶剂萃取、浓缩、结晶等，在酶的分离纯化过程中，应该充分考虑避免酶的变性失活。一般情况下，所有分离纯化操作都应在低温条件下进行，而且要防止过酸、过碱、重金属离子、变性剂、剧烈搅拌等因素对酶活性的影响。近年来，高效液相层析（ HPLC ）和电泳技术越来越发达。4.2 测量时，应将剩余的酶液保存于适合温度下的冰箱中，以防止酶液的变性或失活。因此，可增加对实验的设计，考察不同温度梯度下，酶液活力的变化，并寻找在其他适合条件下，酶