分子印迹技术-1.doc

分子印迹技术分子印迹，又称分子烙印（molecular imprinting），属超分子化学范畴，是源于高分子化学，生物化学，材料科学等学科的一门交叉学科。分子印迹技术（molecular imprinting technique, MIT）是指制备对某一特定的目标分子（模板分子，印迹分子或烙印分子）具有特异选择性的聚合物的过程。它可以被形象地描绘为制造识别“分子钥匙”的“人工锁”的技术。分子识别在生物进化中起着特别重要的作用，是从分子水平研究生物现象的重要化学概念，已成为当今研究的热点课题之一。选择性是分子识别的重要特征。人们利用一些天然花合屋如环糊精，或合成化合物如冠醚，杯芳烃和金刚烷等模拟生物体系进行分子识别研究，取得了一些可惜的进展，一定意义上构成了分子印迹技术的雏形。分子印迹技术的出现直接来源于免疫学的发展，早在20世纪30年代，Breinl,Haurowitz和Mudd就相继提出了一种当抗体侵入时生物体产生抗体的理论。后来在20世纪40年代，由著名诺贝尔奖获得者Pauling对上述理论做了进一步的阐述，并提出了以抗原为模板来合成抗体的理论。该理论认为：抗原物质进入机体后，蛋白质或多肽链以抗原为模板进行分子自组装和折叠形成抗体。虽然Pauling的理论被后来的“克隆选择理论”所推翻，但是在他的理论中仍有两点具有一定的合理性，也为分子印迹的发展奠定了一定的理论基础，同时激发了人们以抗原或待测物为模板合成抗体模拟物的设想；（1）生物体所释放的物质与外来物质在空间上相互匹配。1949年，Dickey首先提出了“专一性吸附”这一概念，实际上可以视为“分子印迹”的萌芽，但在很长一段时间内没有引起人们足够的重视。直到1972年由德国Heinrich Heine大学的Wulff研究小组首次报道了人工合成分子印迹聚合物之后，这项技术才逐步为人们所认识。特别是1993年瑞典Lund大学的Mosbach等在Nature上发表有关茶碱分子印迹聚合物（molecularly imprinted polymers,MIPs）的研究报道后，分子印迹技术得到了蓬勃的发展。迄今，在分子印迹技术的作用机理，分子印迹聚合物制备方法以及分子印迹技术和分子印迹聚合物在各个领域的应用研究都取得了很大的进展，尤其是分析化学方面的应用更是令人瞩目。分子印迹技术的应用研究所涉及的领域非常宽泛，包括分离纯花，化学催化和模拟生物转化，分析传感等。每年公开发表的学术论文数也呈直线趋势上升，1992年仅有12篇，而2001年则增至300篇左右。1997年在瑞典Lund大学成立了国际性的分子印迹学会（Society for Molecular Imprinting,SMI）,其宗旨是“致力于分子印迹科学与技术的全面发展”（committed to excellence in allaspects of molecular imprinting science and technology）。目前该学会已有数百名来自世界各地的会员。根据SMI的统计，目前全世界至少有100个以上的学术机构和企事业团体在从事分子印迹技术的研究及开发工作，且主要集中在瑞典，德国，美国，英国，日本，中国等10多个国家。欧共体（European Commission）于1998年启动了一项计划，旨在资助欧洲8个研究小组从事分子印迹聚合物的制备，结构表征以及将分子印迹聚合物用于临床分析，环境分析以及生物分析等方面的研究。我国从事该领域的研究还不足10年，主要研究单位有中科院大连化学物理研究所，中科院兰州化学物理研究所，军事医学科学院读物所，防化研究院，南开大学，天津大学，北京大学，吉林大学，湖南大学，上海大学等科研院所和高等学校。2000年7月英国加的夫大学举行的第一届分子印迹技术国际会议上，来自世界各地的一百多位专家学者交流了112篇论文。非共价分子印迹聚合物创始人之一Mosbach首先回顾了印迹技术的过去和现在，并展开了其未来发展趋势和动态；而共价型分子印迹的创始人之一Wullf则评述了共价型分子印迹技术的优缺点。对分子印迹中若干关键问题，如分子印迹聚合物的分子设计和组合化学筛选，分子印迹聚合物作为催化剂的研究进展，分子印迹技术作为分离介质的特殊性分析，基于分子印迹聚合物制作的模拟传感器，水溶性分子印迹聚合物的制备及其应用等，大会邀请的专家都做了非常精彩的专题论述。19992002年的上半年，有关分子印迹聚合物的文献中，比较有代表性的综述文章有32篇。其中有中文综述8篇，分别对分子印迹技术原理和特点，分子印迹聚合物的制备方法以及分子印迹聚合在传感器，液相色谱固定相，固液翠取等领域的应用研究进展进行了介绍和评述；英文综述有24篇，内容分别涉及分子印迹聚合物的制备方法和指导原则（包括制备分子印迹聚合物常用的功能单体，交联剂，致孔溶剂等）和分子印迹聚合物的应用，这些应用主要有分子印迹聚合物在化学转化（化学合成和催化剂）中的应用，分子印迹聚合物在生物医学（免疫分析和抗体模拟）中的应用及其面临的技术挑战，分子印迹聚合物用作色谱（液相色谱，毛细管电泳色谱等）固定相，固相萃取材料，膜分离和传感材料，分子印迹聚合物制备方法的最新进展以及分子印迹技术用于生物大分子的识别等。最近几年，在各种国际科技和学术期刊上发表的有关MIP的论文超过了300篇。分析化学趋向（Trends in Analytical Chemistry）在1999年第3期还出了关于分子印迹聚合物的专刊。在此期间的美国化学会第217224次全国会议上，有80篇左右关于分子印迹聚合物的文章，其内容主要涉及以下方面：分子印迹聚合物作为高选择性和高催化活性的模拟生物催化剂，在水相中制备的分子印迹聚合物对甾族化合物和氨基酸，蛋白质，多肽等生物活性分子的识别，用分子印迹技术从水中去除有毒有害化合物，分子印迹聚合物的微制造加工，用分子印迹聚合物筛选抗体药物等等。分子印迹技术所以发展如此迅速，主要是因为它有三大特点：构效预定性（predetetermination）,特异识别性（specific recognition）和广泛实用性（practica-bility）。基于该技术制备的分子印迹聚合物具有亲和性和选择性高，抗恶劣环境强，稳定性好，实用寿命长，应用范围广等特点。因此，分子印迹技术在许多领域，如色谱分离，固相萃取，访生传感，模拟酶催化，临床药物分析，吸附膜分离等得到日益广泛的研究和开发，有望在生物工程，临床医学，天然药物，食品工业，环境监测等行业形成产业化规模的应用。同时，分子印迹技术对研究酶的结构，认识受体-抗体作用机理及在分析化学等方面具有重要的理论意义和实用价值。第2章 分子印迹技术理论分子印迹技术是指为获得在空间和结合位点上与某一分子（模板分子，印迹分子）完全匹配的聚合物的制备技术。实现分子印迹通常要经过3个步骤。 （1）功能单体和印迹分子在一定条件下形成某种可逆的复合物。 （2）加入交联剂将这种复合物“冻结”起来，制得高聚物。 (3)将印迹分子抽提出来，这样在聚合物的骨架上便留下了一个对印迹分子有“预定”选择性的空间和结合位点（binding sites）。根据印迹分子和功能单体形成复合物时作用力的性质，分子印迹可以分为共价型和非共价型两种不同类型，其中非共价型的研究和应用更为普遍。由于分子印迹技术的研究历史相对较短，不少研究者都集精力于分子印迹聚合物的制备方法和用途的研究和探索上，而有关分子印迹过程的热力学和动力学等相关理论的定量和系统的报道还比较少见。21 分子印迹技术的基本概念和原理在生物体内，分子复合物的形成通常需要借助非共价键（氢键，范德华力，离子键等）相互作用。虽然单个非共价键比单个共价键键能低，但多重非共价键的藕合和多个作用位点的协同则会形成很强的相互作用，从而使复合物具有很高的稳定性。由Pauling抗体形成理论出发，当模板分子与聚合物单体接触时会尽可能地同单体形成多重作用点，如果通过聚合，把这些多重作用点固定或“冻结”下来，当模板分子除去后，聚合物中就形成了与模板分子在空间和结合位点上相匹配的具有多重作用点的空穴，这样的空穴对模板分子具有选择性。分子印迹技术是通过以下方法实现的。（1）在适当的介质中，具有适当功能基的功能单体通过与模板分子间的相互作用聚集在模板分子周围，形成单体-模板分子复合物。（2）功能单体与过量的交联剂在致孔剂的存在下形成聚合物，从而使功能单体上的功能在特定的空间取向上固定下来。（3）通过一定的物理或化学方法把模板分子脱除。这样就在聚合物中留下一个与模板分子在空间结构上完全匹配，并含有与模板分子特异性结合的功能基的三维空穴（如图2-1）。这个三维空穴可以选择性地重新与模板结合，即对模板分子具有专一性识别作用。这个三维空穴的空间结构和功能单体的种类是由模板分子的结构和性质决定的。由于用不同的模板分子制备的分子印迹聚合物具有不同的结构和性质，所以一种印迹聚合物只能与一种分子结合，类似于“锁”和“钥匙”，也就是说印迹聚合物对该分子具有选择性结合作用。分子印迹与模板聚合类似，它们都是利用单体或生成的聚合物与模板分子通过氢键，静电结合和范德华力等相互作用，经单体聚合后产生具有一定结构的聚合物。分子印迹与模板聚合主要的不同之处在于：模板聚合是指单体与聚合物模板共同存在下所进行的聚合反应。起模板作用的聚合物对聚合反应速度和聚合物的最终结构有着重要和特殊的影响作用，能得到具有一定聚合度和规整立体结构的聚合物。通常，模板聚合是以聚合物为模板，而分子印迹聚合可以以任何分子为模板。模板聚合产物通常是线型分子，而分子印迹聚合物则是具有高交联度的热固型高分子。22 分子印迹技术的分类按照单体与模板分子结合方式的不同，分子印迹技术可分为预组织法和自组装两种基本方法，如图2-1所示221 预组织法（preorganization）又称共价法，由德国的Wulff及其同事在20世纪70年代初创立。在此方法中，模板分子（印迹分子）首先通过可逆共价键与单体结合形成单体模板分子复合物，然后交联聚合，聚合后再通过化学途经将共价键断裂而去除印迹分子。共价键作用的优点是聚合中能获得在空间精确固定排列的结合集团。若印迹分子能以高百分比除去，则是一类很好的功能材料。对用于催化剂的聚合物来说，其内部结合基团的方向和空穴中起催化作用的活性基团极为重要，此情况下共价键结合作用较为有利。迄今使用的共价结合作用的物质包括硼酸酯，席夫碱，缩醛酮，酯和螯合物等。其中最具代表性的是硼酸酯，其优点是能够生成相当稳定的三角形的硼酸酯，而在碱性水溶液中或在有氮（NH3，哌啶）存在下则生成四角形的硼酸酯。这种四角型的硼酸酯与二醇能极快地达到平衡，其平衡速度与非共价键作用相当。在空穴中若含有两个硼酸基团的分子印迹聚合物，用于拆分印迹分子的外消旋体时会呈现出很高的选择性。但是，并不是结合位点越多，其选择性越高。研究结果表明，3个硼酸基团，3种不同的共价键结合作用或3种以上的非共价键结合作用均导致较低的分离能力，其主要原因是这类分子印迹聚合物的结合位点与印迹分子之间的结合速度很慢。目前已经有商品化的苯乙烯基硼酸出售。采用席夫碱的共价键作用也进行了广泛的研究。Shea等利用缩酮引入结合基团，羰基基团之间不同距离的二酮用可聚合当用二醇处理，然后除去印迹分子有很高的选择性。总之，由于共价键作用一般较强，在印迹分子自组装或识别过程中结合和解离速度慢，难以达到热力学平衡，不适于快速识别，而且识别能力与生物识别差别甚远，因此这种方法发展缓慢。222 自组装法自组装法（self-assembling）又称非共价法，由瑞典的Mosbach及其同事在20世纪80年代后期创立。在此方法中，模板分子（或称印迹分子）与功能单体之间自组织排列，以非共价键自发形成具有多重作用位点的单体模板分子复合物，经交联聚合后这种作用保存下来。常用的非共价作用有：氢键，静电引力，金属螯合作用、电荷转移、疏水作用以及范德华力、以氢键应用最多。需要注意的是，如果在印迹和后续的分离过程中只有氢键一种作用时，其拆分外消旋体的效果往往不佳；而如果在印迹过程中既有氢键，又有其他物理或化学作用时，其拆分外消旋体的分离系数a值很高。Sellergren就静电作用对选择性的影响做了详细的研究，当只有一种静电作用时，获得的分子印迹聚合物选择性降低。而将静电作用与共价作用结合起来，其选择性比单个共价作用的选择性好得多。也有人使用强度小且无方向性的范德华力来形成复合物，其分子识别过程接近天然的分子识别系统。Fujii等首次使用金属配基结合作用制得金属配位分子印迹聚合物，其拆分外消旋体的a值很高。Amold等详细研究了含咪唑的化合物与Cu2+的结合作用。Kempe等在用非共价或非离子作用的分子印迹聚合物研究手性分离时，着重考察了水对分子识别的影响，并同时研究了氢键对疏水性在手性分离中所起的作用.而Dauwe等在研究三嗪类农药的分子印