弯曲杆菌的分离鉴定.doc

弯曲杆菌的分离鉴定主题内容与适用范围 本标准规定了出口食品中弯曲杆菌的检验方法。 本标准适用于出口畜肉、禽肉、水产品和牛奶中弯曲杆菌检验。其他出口食品可参照使用。2设备和材料2.1微需氧培养设备：最佳微需氧条件为5%氧气、10%二氧化碳和85%氮气。可用具双相压力计的厌氧罐、蜡烛缸、气袋或其他可代用的装置。2.2天平：称量2000g,感量0.1g。2.3均质器。2.4离心机：带50mL离心管。2.5显微镜：相差或暗视野。2.6培养箱：25,37和42。2.7水浴箱：37。2.8注射器：20mL。2.9针头过滤器：滤膜孔隙为0.65m。2.10 三角烧瓶：50,250和500mL。2.11 平皿：90或100mm。2.12吸管：1和5mL。2.13 试管：16mm125mm,带螺旋帽。3培养基和试剂3.1弯曲杆菌增菌肉汤：根据用途,加入1号或2号抗生素溶液制成(A1)。3.2弯曲杆菌分离琼脂(改良Skirrow氏培养基) (A2)。3.3含0.18%琼脂的半固体布氏肉汤(A3)。3.4布氏琼脂(A4)。3.5营养肉汤(A5)。3.6中性红溶液(A6)。3.73%过氧化氢溶液。3.8氧化酶试验试剂(A7)。3.9亚硝酸盐检测(硝酸盐还原) 试剂(A8)。3.10 乙酸铅纸条：将滤纸条浸入饱和乙酸铅溶液中,然后取出,使其干燥。3.11 硝酸钾。3.12 甘氨酸。3.13 氯化钠。3.14 盐酸半胱氨酸(cysteine-HCl)。3.15 马尿酸钠(sodium hippurate)。3.16 萘啶酮酸(nalidixic acid): 每个圆纸片含30g。3.17 头孢菌新素(又称先锋霉素,cephalothin): 每个圆纸片含30g。3.18 茚三酮(ninhydrin)。3.19 丙酮。3.20 丁醇。4增菌4.1碎牛肉 使用加有按1号配方配制的抗生素溶液的增菌肉汤。称取25g样品,置于均质杯内,加入100mL增菌肉汤,用均质器以800010000r/min均质30s。将均质液通过灭菌纱布,倒入一个容量为250mL的三角烧瓶,置微需氧条件下,42培养2448h。4.2净膛全禽和分割禽肉 在一个灭菌容器中,用250mL 灭菌营养肉汤振摇洗涤样品5min。取肉汤,经灭菌纱布过滤,于23000g、4离心20min,或于16300g、4离心30min,弃去上清液,将沉淀物混悬放在250mL三角烧瓶中的100mL加有按1号配方配制的抗生素溶液的增菌肉汤中。培养方法同4.1条。4.3牛奶 使用加有按1号配方配制的抗生素溶液的增菌肉汤。称取约40g牛奶放入离心管中,按4.2条中的方法离心。弃去脂肪和上清液,将沉淀物混悬放在250mL三角烧瓶内的100mL,增菌肉汤中,培养方法同4.1条。4.4贝类 使用加有按2号配方配制的抗生素溶液的增菌肉汤。将100g样品和100mL增菌肉汤放入均质杯中,用均质器以800010000r/min转速均质30s。用灭菌纱布将均质液过滤。取50mL滤液放在500mL三角烧瓶内的200mL增菌肉汤中,培养方法同4.1条。4.5其他食品 所使用的增菌方法决定于食品的种类。虾、整只海鱼和海鱼片经表面洗涤法 (4.2条)处理后,用加有按2号配方配制的抗生素溶液的增菌肉汤增菌。羊肉和猪肉块可先用表面洗涤法处理,再用加有按1号配方配制的抗生素的肉汤增菌。碎肉按4.1条所列方法处理。液体食品按4.3条所列方法处理。各种样品的培养方法均同4.1条。5分离和初步鉴定 取5mL经2448 h增菌的培养物,以0.65m孔径滤膜过滤。取经过滤和未经过滤的增菌培养物,分别在分离用琼脂平板上划线接种,各不少于两个平板。将平皿置微需氧条件下42培养2448h。检查平板上有无透明-白色-棕黄色(可能出现浅红色)凸起、边缘不整齐、有时沿接种线向外扩散的菌落。挑取典型菌落制作湿片,用相差(或暗视野)显微镜检查,本菌呈现快速的螺旋样运动。涂片作革兰氏染色镜检时,本菌为革兰氏阴性,如小逗点状,两菌体的末端相接时,呈S形、海鸥展翅形或螺旋状。挑取初步鉴定为弯典杆菌菌落,在布氏琼脂上划线作纯分离。培养方法同上。根据生化、生长特性和抗生素敏感性试验进行菌株证实。6证实6.1生化试验从用作纯分离的平板挑选2个典型菌落。从每个典型菌落各挑取一满接种环,分别接种于放在50mL三角烧杯中的4mL布氏肉汤中,置微需氧条件下42培养2428 h。同时接种一份已知阳性培养物,以在整个证实试验中作为对照。在大多数情况下,用于生长试验和生化反应的基础培养基是含0.18%琼脂的布氏肉汤。这种培养基分装在16mm125mm试管中,每管7mL。从所有布氏肉汤中取出各接种物,滴加0.20.3mL于琼脂表面。6.1.1生长温度试验 接种3管含0.002%中性红(NR)的基础培养基,其中一管置37培养,检查在这一温度下的生长情况,并用于观察过氧化氢酶反应。另两管分别置42和25培养。每日检查有无生长。对未生长者需培养5d,方可作出最后判断。弯曲杆菌的生长应只限于接近培养基表面的一薄层,广泛的生长不是由于弯曲杆菌属细菌所致。6.1.2过氧化氢酶试验 滴加3%过氧化氢溶液于显示有细菌生长的试管内,出现气泡者为阳性反应。6.1.3氧化酶试验 使用琼脂平板表面经24h培养的生长物(也可取用于抗生素试验的平板),将氧化酶试剂滴于棉拭子上,并用棉拭子去接触表面生长物。在接触点出现深蓝色斑点者为阳性。6.1.4硝酸盐还原试验 将供试培养物接种于含1%硝酸钾的基础培养基。置空气中于37培养5d。加入亚硝酸盐检测试剂甲液和乙液(A8),出现红色者表明硝酸盐还原成亚硝酸盐,为阳性反应。6.1.51%甘氨酸中生长试验 将供试培养物接种于加有NR和1%甘氨酸的基础培养基。置空气中于37培养。每日检查有无生长,对未生长者需培养5 d,方可作出最后判断。6.1.63.5%氯化钠中生长试验 将供试培养物接种于加有NR和3.5%氯化钠的基础培养基。置空气中于37培养。每日检查有无生长,对未生长者需培养5 d,方可作出最后判断。6.1.7硫化氢产生试验 将肉汤培养物接种于加有0.02%盐酸半胱氨酸的基础培养基,将一根浸有饱和乙酸铅的滤纸条悬于试管的上部(不让滤纸条接触培养基),旋紧试管帽。置空气中于37培养。每日检查,观察滤纸条是否变黑,纸条变黑表明有硫化氢产生,为阳性反应。对未出现阳性反应者需培养5 d,方可作出最后判断。6.1.8马尿酸盐水解试验 马尿酸盐水解培养基即1%灭菌马尿酸钠溶液,可用试管分装,每管0.4mL,冻存备用。用2mm接种环取一满环在琼脂平板上培养过夜的生长物,接种1%马尿酸钠溶液中,振摇试管以分散培养物,置37水浴中放置2h。在每个试管中加入0.5mL茚三酮试剂 将3.5g茚三酮溶于100mL 1:1丙酮和丁醇的混合物中,将试管于室温下放置2 h。出现紫色者为阳性反应。6.2抗生素敏感性试验 用灭菌棉拭子将预先准备的布氏肉汤培养物涂布于布氏琼脂平板。将含头孢菌新素(30g)和萘啶酮酸(30g)的圆纸片分别贴于平板表面。置微需氧条件下于37培养24h,检查有无抑菌圈。6.3根据下表对细菌作出鉴定弯曲杆菌的特性鉴别 弯 曲 杆 菌试验项目 胎儿弯曲杆菌胎儿亚种空肠弯曲