《生物技术综合大实验》.doc

真菌HOG1及PBS2基因功能验证一、实验原理许多真核生物，在胞外渗透压增加时能够通过提高胞内渗透压进行调节。虽然真核生物能够对胞外信号刺激进行感应并传递信号，但是对细胞发生应答反应的机制了解甚少。酵母在长期的进化过程中，形成了精确而敏感的适应机制。细胞通过感受周围环境的变化，激活胞内信号传导途径，从而对外部环境刺激作出应答，其中之一就是激活高渗透压通路（HOG）的相关因子以适应外部环境的变化（Gustin et al., 1998; George & Sprague, 1998; Estruch, 2000; ORourke & Herskowitz, 1998, 2002）。酿酒酵母通过增加甘油的合成与储存，保持细胞内水分含量，防止细胞脱水和蛋白质集聚，提高细胞内部渗透压，从而对胞外渗透压的增加作出应答反应（Brewater et al., 1993; Sean et al., 2004; Welsh, 2000）。HOG途径是酵母细胞在高渗条件下进行的渗透压调节反应所必需的，它主要通过积累胞内甘油通过细胞膜来维持渗透压梯度。酵母HOG信号转导过程通过HOG MAPK 级联途径完成。HOG途径的主要组成成分是MAPK的模式，即一个MAPK（Hogl），一个MAPKK（Pbs2），和三个MAPKKK（Stell、Ssk2和Ssk22）。在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中，HOG通路受到MAP激酶Hog1p的调控（Alepuz et al., 2003）。MAPK激酶Pbs2p蛋白是Hog1p 的上游激发子，可以通过细胞膜上的两个跨模蛋白Sho1p 及 Sln1p分别引起的两条上游分支通路来激活（Maeda et al., 1995）。酿酒酵母细胞膜上存在两种跨膜渗透压感受器：Sln1 和Sho1。它们能够独立地调控渗透压胁迫条件下HOG途径的激活，这两支上游途径分别被称为SLN1和SHO1途径（de Nadal et al., 2002; Hohmann, 2002; ORourke et al., 2002; Saito & Tatebayashi, 2004; Sheikh-Hamad & Gustin, 2004; Westfall et al., 2004; Marcus et al., 2006）。任意一条分支途径被激活均可引起Hog1的Thr174和Tyr176残基双重磷酸化，并导致Hog1从细胞质向细胞核内转移。进入细胞核的Hog1激活Hot1、Msn2/Msn4、Sko1和/或Smp1等转录因子，这些转录因子进而调控甘油形成所需基因的表达（Marcus Krantz et al., 2006）。甘油的过量表达对细胞是有害的，因此细胞中的蛋白磷酸酯酶（protein phosphatases）Ptp2、Ptc1、Ptc2和Ptc3可以对磷酸化的Hog1进行去磷酸化，从而降低Hog1的活性以达到对甘油合成量的控制。通过对Hog1活性的合理调控，细胞就可以合成所需的甘油量，以应对外界渗透压的变化（ORourke et al., 2002）。HOG通路两个上游分支均可使Pbs2及Hog1磷酸化、转运、功能基因的诱导、以及在高渗环境中生长（Posas & Saito, 1997; Van Wuytswinkel et al., 2000），但是，在Hog1磷酸化时，它们对渗透压的敏感性存在差异（Maeda et al., 1995; Van Wuytswinkel et al., 2000）。此外，Pbs2 通路上游Sho1分支还对假菌丝的发育有关（ORourke & Herskowitz, 1998; Ramezani Rad et al., 1998）。因此，Sho1 和Sln1分支可能决定不同靶基因的转录过程（见图1.1）。图1.1 酵母细胞HOG通路模式图Fig 1.1 Model of HOG pathway in the yeast cellHOG途径不仅是渗透压胁迫的各种反应所需的，而且也是由高渗胁迫激活的（Gustin et al., 1998）。HOG途径在诱导胁迫反应基因的表达，细胞形态恢复和信息素反应途径的阻遏及其致病性等方面都起重要作用。胁迫反应时，MAPK级联反应途径在调节细胞周期方面起非常重要的作用（Degols et al., 1996）。胁迫反应途径作为一种细胞周期的正调节因子的生理功能预示胁迫能促进细胞周期。 二 实验目的了解并掌握真核基因功能研究方法；掌握酵母菌感受态制备方法及转化方法。三、试验材料3.1 主要试剂、酶、菌株酵母质粒提取试剂盒（100次）、细菌质粒小提取试剂盒（100次）；ssDNA、PEG 4000、Li Ac、Nacl、Yeast Extract及Peptone、无氨基酸酵母氮原（Yeast Nitrogen Base without amino acids，YNB）及各种氨基酸；BsrG I酶，DNA Marker分子量为15000bp一管，2000bp一管；酿酒酵母hog1基因缺失突变菌株Uva17及pbs2基因缺失突变菌株Uva18；pRS-AtHOG1-166阳性菌株（E.coli）、pRS-AtPBS2-466阳性菌株（E.coli）、pRS-Dest42菌株（E.coli）。3.2 主要实验仪器及耗材0.22 m一次性滤器（40个）、50ml的一次性注射器（40个）、蓝、黄、白枪头各一盒/组、250ml三角瓶5个/组、1.5ml离心管若干、带盖50ml离心管2个/组、90mm培养皿20套/组。超净实验工作台、高速离心机、微量加样器、凝胶成像系统、紫外分光光度计、水平电泳仪。四 试验方法4.1 培养基制备YEPD培养基200ml/组（配方见表1）；SD-URA培养基200ml/组（配方见表2）；10倍氨基酸混合液无尿嘧啶溶液（配方见表3）。表1 YEPD培养基配方表酵母提取物（Yesat extract）10 g胰蛋白胨（Peptone）20 g葡萄糖（Glucose）20 g琼脂粉 20 g超纯水定容至 1000 ml调整pH值至7.0，15 psi（1.05 kg/cm2）高压，蒸汽灭菌20分钟，室温备用。表2 SD-URA培养基配方表无氨基酸酵母氮原（YNB）6.7 g10倍氨基酸混合液无尿嘧啶（无URA）100 ml葡萄糖（Glucose）20 g琼脂粉20 g超纯水定容至1000 ml调整pH值至7.0，15psi（1.05 kg/cm2）高压，蒸汽灭菌20分钟，室温备用。表3 10倍氨基酸混合液配方表成分用量硫酸腺嘌呤20 mgL-精氨酸盐酸盐20 mgL-组氨酸盐酸盐20 mgL-异亮氨酸30 mgL-亮氨酸100 mgL-赖氨酸盐酸盐30 mgL-蛋氨酸20 mgL-苯丙氨酸50 mg苏氨酸200 mgL-色氨酸40 mgL-酪氨酸30 mgL-缬氨酸150 mg超纯水定容至100 ml0.22 m滤器过滤除菌，-20保存备用。4.2 pRS-AtHOG1-166质粒、pRS-AtPBS2-466质粒的提取（方法引用质粒试剂盒提取的方法）质粒提取依据东盛生物公司高纯度质粒小量提取试剂盒操作手册进行，其步骤如下：(1) 3 ml培养过夜菌液12000 rpm室温离心一分钟，收集菌体；(2) 弃上清，把沉淀完全悬浮于250 l溶液1（已经加入RNaseA）中；(3) 加入250 l溶液2，室温下轻轻颠倒混匀710次，至菌液透明，室温放置2 分钟；(4) 加入350 l溶液3，室温下轻轻上下颠倒混匀710次至白色沉淀出现；(5) 12000 rpm，室温，离心10分钟，将上清液加入一个新的DNA纯化柱中，室温放置12分钟；(6) 12000 rpm，室温，离心1分钟，倒掉收集管的废液；(7) 加入500 l溶液PB（已加入无水乙醇），12000 rpm，室温离心30秒，倒掉收集管中的废液；(8) 加入500 l溶液W，12000 rpm，室温离心30秒，倒掉收集管中的废液；重复此步骤一次；(9) 12000 rpm，室温离心3分钟，尽量将乙醇去除干净；(10) 将DNA纯化柱置于新的离心管中。向纯化柱中央处悬空滴加50-100 l溶液Eluent，室温放置2min。12,000 rpm离心1min，管底即为高纯度质粒DNA。(11) 为了提高质粒的回收效率，将得到的溶液重新加回离心咐附柱中，重复步骤（10）；离心管中收集的液体即是洗脱下来的质粒DNA，取5 l质粒DNA电泳检测（1%琼脂糖凝胶），Marker为DL15000、2000。并使用Bio-rad分光光度计测定质粒的质量。4.3 pRS-AtHOG1-166质粒、pRS-AtPBS2-466质粒BsrG I酶切cDNA片段重组入pRS-DEST42质粒载体后，在特异重组位点attL1和attL2中含有2个BsrG I限制性内切酶酶切位点，通过对质粒载体酶切电泳检测，可以检测插入片段的大小。酶切反应体系如下：10 Buffer2 l100BSA0.2 l质粒DNA3 lBsrG0.5 l灭菌超纯水14.3 l每个样品取10 l酶切产物电泳（1%琼脂糖）检测，确定质粒插入片段的大小。4.4 pRS-AtHOG1-166质粒、pRS-AtPBS2-466质粒转化酵母菌转化方法采用PEG/LiAc/ssDNA法。LiAc使得受体细胞中产生了一种短暂的“感受态”，在此期间它们能够摄取外源DNA，较低浓度的LiAc作用可以减少锂离子对膜结构的损伤，使转化后的酵母细胞容易在选择性培养基上生长。PEG4000可以促使膜负载的改变，从而达到协助转化的目的。ssDNA起到保护质粒免受核酸酶的降解。转化方法依据美国冷泉港实验室手册稍作改进，其步骤如下：(1) 接种一个酵母单菌落（UVA17与UVA18）于5 ml液体YEPD中，200 rpm，30，振荡培养过夜；(2) 转接于50ml液体YEPD中，200 rpm，30，振荡培养至OD600为1.0；(3) 室温，3000 g离心5分钟收集菌体，加入25 ml无菌双蒸水重悬菌体，再次离心；(4) 菌体重悬于1 ml 100 mM LiAc中，室温，最高速离心5秒，弃上清；(5) 菌体重悬于100 mM LiAc中，终体积为500 l；(6) 适量ssDNA溶液煮沸变性5分钟后，迅速放入冰水中冷却备用；(7) 重悬菌体，吸取50 l，离心去除上清；(8) 按以下体系依次加入溶液（加样顺序不可颠倒） 360 l PEG 4000（60） 200 l Li Ac（1 M） 36 l ssDNA（5 mg /ml） 10 l dd H2O 104 l plasmid DNA 0.110 g (9) 振荡混匀1 分钟，30，温育30 分钟；(10) 42，水浴2045分钟；(11) 60008000 g室温离心15秒，弃上清；(12) 200 l 灭菌dd H2O温和重悬菌体；(13) 根据需要涂布SD-URA平板，并计算转化效率（cfu/g）。pRS-AtHOG1-166质粒、pRS-Dest42质粒1 g分别转化酵母hog1缺失菌株Uva17 pRS-AtPBS2-466质粒、pRS-Dest42质粒1 g分别转化酵母pbs2缺失菌株Uva18后，全量涂布于90 mm的SD-URA琼脂培养基，30，培养2天，生长出的转化子划线接种于YEPD+1MNaCl琼脂培养基，以pRS-Dest42酵母菌株分别作为对照，30，培养2天。观察结果。转化效率（cfu/ g）可按以下公式计算：转化子数(cfu)悬浮体积(l)涂布体积(l)稀释因子总质粒量(g)五 结果与讨论1、质粒提取电泳结果图如下所示：123456图右边标示的是我们组点样的孔，从上往下分别是：1.5000marker，2. pRS-AtPBS2-466质粒，3. pRS-AtPBS2-466质粒，4. pRS-AtHOG1-166质粒，5. pRS-AtHOG1-166质粒，6.DNA。质粒的密度与电泳条带的亮度有关，从现场和图片中可以观察到，我们组没有成功跑出pRS-AtPBS2-466质粒的条带，但成功跑出了pRS-AtHOG1-166质粒的条带，且pRS-AtHOG1-166质粒的密度从亮度中可以推测为60ng/ul。经讨论分析，我们认为，我们组没能跑出pRS-AtPBS2-466质粒条带的原因可能有以下几点：与我们在给pRS-AtPBS2-466质粒接种的时候，没有接种正确，也就是没有挑取正确的菌落，以致接种后没有长出我们要求的菌液。前一天接种的4管菌液（2管pRS-AtHOG1-166质粒和2管pRS-AtPBS2-466质粒），第二天只有一管pRS-AtPBS2-466质粒菌液才成长，从质粒提取的结果我们推测，其中那管长了的质粒也只是污染的结果。基于4只有一管pRS-AtPBS2-466质粒的长了，我们在提取质粒的时候是采用其他组的pRS-AtHOG1-166质粒样和本组的pRS-AtPBS2-466质粒样，从结果可以看出，其他组的pRS-AtHOG1-166质粒接种正确，在结合质粒试剂盒提取的提取步骤，所以在质粒提取时获得较高量的质粒。总的来说，我们组在质粒提取方面是成功的。2、质粒酶切电泳结果如下所示：12345图右边标示的是我们组点样的孔，从上往下分别是：1. pRS-AtPBS2-466质粒酶切产物，2. pRS-AtPBS2-466质粒酶切产物，3. pRS-AtHOG1-166质粒酶切产物，4. pRS-AtHOG1-166质粒酶切产物，5.2000marker。从现场和图片中可以观察到，电泳条带没有跑得很开，也就是酶切产物没有彻底分离开来，酶切结果并不好，条带都聚集在一起。经讨论分析，我们认为，我们组虽在质粒提取的过程中获得了较大量了pRS-AtHOG1-166质粒，但在酶切的电泳图谱中没有将酶切产物彻底分离，比较标准的电泳图谱应像我们左边的那个条带那样，造成这种结果的原因可能是BsrG I酶切不彻底，以至于条带长度不分散。3、pRS-AtHOG1-166质粒、pRS-AtPBS2-466质粒转化酵母菌的SD-URA平板的涂布结果如图所示： 图一二三四是6月2号拍的。图ABCD是6月3号拍的，在2号的基础下，再在30的条件下培养24h，观察结果。 从现场和图片中可以观察到，图二菌落比较分散比较大，符合实验设计的预测结果，转化效率比较符合科学依据。图一三四菌落太小、数量太多，不符合科学依据。 经讨论分析，我们认为，造成这种结果的原因可能有以下几点：在涂布平板的时候，没有涂布均匀；培养基配制或倒平板的过程中出现差异，导致培养基比例不一致（培养基灭菌前没有煮，灭菌之后显得不那么均匀，稍显浑浊，所以我们觉得培养基配制时，还是应该一边煮一边搅拌才会均匀一些。）；操作不当引起杂菌污染；稀释涂布过程中菌液浓度过高，比例不一致，导致部分培养基中初始菌数过高； 图二：pRS-AtPBS2-466质粒转化酵母菌pbs2缺失菌株Uva18图一：pRS-AtPBS2-466质粒转化酵母pbs2缺失菌株Uva18图四：pRS-AtHOG1-166质粒转化酵母hog1缺失菌株Uva17图三：pRS-AtHOG1-166质粒转化酵母hog1缺失菌株Uva17从图ABCD可以看