嗜水气单胞菌研究进展.doc

嗜水气单胞菌研究现状一、 流行及感染情况嗜水气单胞菌属于弧菌科, 气单胞菌属。气单胞菌属根据有无运动力可分为两类; 一类是嗜冷性、非运动性的气单胞菌, 另一类为嗜温性、运动性的气单胞菌。嗜水气单胞菌属第二类, 在气单胞菌属中是最重要的, 它是气单胞菌的模式种。非运动性气单胞菌主要是对鲑鳟鱼等致病的杀鲑气单胞菌及其亚种。嗜水气单胞菌在过去有不同的名称, 主要的名称有点状气单胞菌和斑点气单胞菌嗜水气单胞菌广泛存在于淡水、污水及土壤。有很多资料记载, 嗜水气单胞菌对水产动物、家畜和人均有致病性, 在动物疾病学和食品卫生学研究上都具有重要意义。它能广泛地被分离到, 如在淡海水鱼,淡水虾类, 淡水蟹类中和养殖蛙体内, 也能引起爬行类疾病。有许多报道证明它也能感染人类发病, 最常见的是嗜水气单胞菌引起急性霍乱。同时, 它广泛分布于人类的食物链, 供水系统和土壤中。嗜水气单胞菌既是恒温动物与变温动物的条件致病菌, 又是原发致病菌。但是, AUSTIN 等报道嗜水气单胞菌通常在自然界是条件致病菌, 充当继发病原而不是原发病原。嗜水气单胞菌通常与其它病原菌如温和气单胞菌、豚鼠气单胞菌和假单胞菌有密切关系, 但由于鱼的品种不同而表现出不同的临床症状。病鱼的临床症状为局部损伤、坏死、水肿、突眼及腹部膨胀, 另外可能产生腹水、贫血及破坏内脏器官, 脾、肾颜色变黑, 肝变白, 胆汁变黄。在鱼、蛙类中由于嗜水气单胞菌感染引起的临床症状不同而给出了许多不同的名称, 如鲈鱼和鲤鱼的“红痛病”; 鲫鱼、白鲢、花鲢的“暴发病”, 这些鱼出现典型的肌肉、内脏的出血性败血症。在虹鳟, 鲶鱼中的嗜水气单胞菌病被称为“坏死病”, 这些鱼的嘴周围鳞片腐蚀, 身体的深部出现坏死及烂鳃。虹鳟鱼由于嗜水气单胞菌的感染而得的病称为“红嘴病”, 病鱼行动迟缓, 通常由于色素的过量产生而体色发黑, 口腔呈粉红或红色发炎, 外表及内部器官均呈现局部出血, 在病鱼的后期阶段, 病鱼呈急速螺旋状运动, 下沉, 腹部朝上直至死亡。“红腿病”蛙的后肢及腹部呈现出血性败血症, 病蛙的心、肝、肾及脾受到破坏, 并出现腹水。二、 血清型嗜水气单胞菌有4种抗原, 包括耐热的O抗原、不耐热的K 抗原、鞭毛H 抗原和菌毛抗原。Ew ing等提出共有12种O抗原和9 种H抗原, 每组都能进一步分型。此后, 日本国立康复研究院(NIH )分出了44个O抗原血清型,而Thomas又在此基础上增加了52个血清型, 从而达到了96个O抗原血清型, 且O 3、O 11、O 16、O 17、O 34被认为是主要血清型。Thomas等又在NIH的基础上增加了52个血清型, 并得到O3、O11、O16、O17、O34是主要的血清型, 其中O11、O16、O34是人源分离株常见, 而且毒力很强, O11、O19、O34主要对鱼致病. 国内方面研究, 人源也主要是O11、O16、O34, 而鱼源多为O9和O5。三、 毒力因子嗜水气单胞菌产生的并得到认可的毒力因子主要包括外毒素、胞外蛋白酶、S蛋白、菌毛、外膜蛋白、脂多糖等.1 外毒素(exotoxin)嗜水气单胞菌所产生的外毒素是重要的致病因子之一由于嗜水气单胞菌的基因型的多样性,导致其外毒素的基因差异很大,表现为不同嗜水气单胞菌的外毒素有所差别. 到目前为止已确定的外毒素有气溶素(aerolysin)溶血素(hemolysin)、溶血毒素(hemolytic toxin)和细胞毒性肠毒素(cytolyticenterotoxin)等。虽然外毒素名称各异,但这些毒素都是单一多肽分子,具有相同的生物学活性:溶血性、肠毒性和细胞毒性,在结构和功能上都极为相似, 所以可以认为外毒素属于同一基因家族. 国际上将外毒素的命名为气溶素(Aer毒素)。在国内,陆承平、涂小林等取嗜水气单胞菌产生的溶血素(hemolytic toxin)肠毒素(enterotoxicity )及细胞毒素(cytotoxicity)三个词的第一字母,命名为HEC毒素。但是, Rose通过比较不同外毒素的氨基酸序列发现, 虽然生物学活性很相近, 但是氨基酸序列有明显的差异。 Wong和Albert也分别从基因水平上证明了不同的外毒素的基因结果虽然有一定的同源性, 但是仍然存在着差异。 这样就与国际和国内的统一的命名有了矛盾, 国际上Buckley&Howard和Chopra&Houston对此也有不同意见, 但为了有利于研究的系统进行以及文献的检索引用方便, 后者接受了国际上的统一命名气溶素(aerolysin)。2 胞外蛋白酶(extracelluar protease)嗜水气单胞菌的胞外蛋白酶也是主要的致病因子之一, 其家族成员比较多. 现在比较认可的分类是将其分为热敏感丝氨酸蛋白酶和热稳定金属蛋白酶。因为种类的繁多, 而且不同细菌的产生的蛋白酶也有差异, 同一细菌在不同生长期产生的蛋白酶也有所不同, 而且其种类和性质随着菌株、培养条件、纯化方法不同而不同, 所以不同的研究者针对不同细菌研究所报道的结果也有所不同. 胞外蛋白酶具有致病性, 不同的研究者在不同的实验中都给予了证明。蛋白酶除了可以协同其他毒力因子共同作用机体之外还具有活化其他致病因子的作用, 嗜水气单胞菌分泌的外毒素是无活性的前提形式存在的, 必须经过蛋白酶作用将前体C末端的蛋白降解才能发挥生物学活性. 这也就可以解释为什么有些学者的研究报道与以上结论相悖, 虽然有些蛋白酶没有直接致病性, 但其可以协助其他毒力因子发挥毒性作用. 蛋白酶的种类比较多, 有的蛋白酶有直接的致病性(热稳定金属蛋白酶), 有的就没有直接的致病性(热敏感丝氨酸蛋白酶), 不排除这些学者研究的就是可以直接致病的蛋白酶种类。3 S 层蛋白嗜水气单胞菌S蛋白是组成其表面S层的蛋白亚单位, 有规则地排列在菌体表面,完整地包裹着菌体,具有抗吞噬、抗补体等作用. S层和菌毛、外膜蛋白等是嗜水气单胞菌的粘附因子,没有这些结构,菌体则不能粘附于上皮细胞,从而很快被机体清除,无法成功定植,更无产生和分泌外毒素的机会. 结合国内外研究结论, S蛋白的相对分子量在51500左右, 由天门冬氨酸等16种氨基酸组成,其中疏水性氨基酸占35%-42% ,酸性氨基酸的比例高于碱性氨基,不含半胱氨酸(严亚贤报道有). 不同菌株S蛋白N端序列之间无同源性,说明不同毒株S蛋白的免疫原性有所不同. 生物学活性显示S蛋白对Vero细胞有轻微的细胞毒性(致Vero细胞变圆,但不脱落),但无溶血性,对鲫鱼和小鼠也无致死作用. 嗜水气单胞菌的S层的功能目前可以总结为两方面. 一方面S层是嗜水气单胞菌的一种粘附素；另一方面S层是嗜水气单胞菌的主要表面抗原,在嗜水气单胞菌的感染与免疫保护中起重要作用.但是S蛋白N端序列之间无同源性导致不同毒株S蛋白的免疫原性也有所不同. 因此S蛋白作为免疫原应慎重考虑, 只能针对同源菌进行.4 菌毛(fimbriae)菌毛是嗜水气单胞菌的重要的粘附素,帮助细菌的定植. 嗜水气单胞菌的菌毛从S层晶格网孔伸出菌体外.根据菌毛形态的不同可以分为W(wavy)菌毛和R(ragid). W菌毛长而易弯曲, 菌毛数量少,与细菌的粘附及血凝作用有关,是一种粘附素。W菌毛在嗜水气单胞菌属不同菌株之间的同源性很低, Alice在其研究中以Ah26嗜水气单胞菌的W菌毛编码基因为探针对相关和非相关菌株进行DNA-DNA杂交, 结果发现于其他菌株没有杂交.这证明了其在不同菌株间同源性低的事实。R( ragid)菌毛短而硬,数量多周身分布, 与细菌的自凝作用有关,与血凝作用无关,不是粘附素. 菌毛也是毒力因子之一, 与毒力有一定的关系, Lalliter的研究表明强毒株的菌毛与弱毒株的菌毛虽然在形态上没有什么差异, 但是强毒株的抗血清只能和强毒力的菌株发生凝集而与弱毒力的菌株没有反应55.5 外膜蛋白(OMP)外膜蛋白是革兰氏阴性菌外膜的主要结构,含有多种蛋白成分. 是嗜水气单胞菌重要的黏附因子和保护性抗原, 与细菌的毒力也密切相关。根据其分子量大小可以分为22000 , 31000 ,38000 , 43000 , 50000等五种, 其数量和种类随着不同菌株及菌株的不同培养条件而有所变化.6 脂多糖(LPS)脂多糖是嗜水气单胞菌的内毒素, 表现的毒性作用主要有热原性,白细胞数目减少或增多,弥漫性血管内凝血,神经症状及休克以至死亡等. 病原产生和释放的脂多糖内毒素类物质是可以引起感染机体发病和死亡, 但由于嗜水气单胞菌的致病因子繁多, 是否是主要原因以及这些毒力因子之间是怎样协同发挥毒性作用还值得进一步研究. 除了毒性作用外, 其O抗原脂多糖还具有黏附因子的作用, 而且一些脂多糖与OMP形成的复合物还与血凝性和细胞粘附有关。除此之外, 还有一些学者报道了相关的毒力因子, 如几丁质酶、淀粉酶、分子量从15.5kDa的乙酰胆碱酯酶(acetylcho line esterase) 到110kDa的核酶以及铁载体( siderophore)等. 总之, 嗜水气单胞菌的毒力因子很多,而且复杂. 他们对机体发挥毒性作用时也不是单个因子作用, 而是相互协同作用的, Yu等通过基因插入和基因敲除等技术首次比较不同毒力因子在嗜水气单胞菌致病中的作用, 指出各毒力因子是相互协作共同作用于机体。四、 致病机理嗜水气单胞菌的致病性和它的分布一样的广, 首先是致病的动物群体广泛, 可以引起包括人在内的多种哺乳动物, 鱼类, 蛙类, 爬行类等发病, 对水生鸟类也有报道发病, 陆生鸟类发病报道较少, 但最近几年对于禽类的致病报道的越来越多.其次, 细菌在进入机体内以后可以通过不同的途径方式, 对机体的不同器官进行破坏. 例如：可以引起儿童腹泻、人的胆囊炎、腹膜炎、脑膜炎、肺炎和体外创伤感染等. 感染嗜水气单胞菌的鱼、鳖等水生动物表现出的主要共同的症状为体表充血、出血,有的会有肠壁出血现象,肝、肾、脾等内脏器官也会有出血现象. 组织病理观察血管中的红细胞变形、溶解,白细胞数量减少等病理变化,毛细血管壁受损,引起出血;细菌侵入肝、肾、脾等组织器官,引起炎症。嗜水气单胞菌是条件致病菌,在适宜的条件下,如环境条件差, 机体的状态不好, 抵抗力下降等, 菌体就会趁机侵入机体并大量繁殖, 从而引起机体的发病. 以养渔业为例, 鱼体表面的受伤, 放养的密度过大, 水质差, 过多的有害物质富含, 营养缺乏等都给嗜水气单胞菌的侵入创造了良好的前提条件.嗜水气单胞菌对机体细胞的侵袭起始于细菌对上皮细胞的粘附,紧接着是细菌的内化和繁殖, 进而会引起细胞的溶解和组织的损伤. 病原菌的侵入除与细菌表面黏附因子有关外,还与细胞表面受体、细胞骨架以及信号转导等机制有关. 储卫华等以HEp22细胞作为体外模型,对嗜水气单胞菌J-1的侵袭机制进行详细的研究. 通过以上机制细菌进入机体, 细菌在侵入到机体内之后大量繁殖, 夺取机体的营养物质, 使得机体的抵抗力进一步下降, 造成更多的细菌的侵入. 同时大量繁殖的细菌会产生大量的毒力因子, 破坏机体. 这些毒力因子发挥毒性作用, 使肠道积液, 分泌增多, 红细胞裂解,吞噬白细胞,损坏毛细血管,引起败血、出血, 细胞毒素侵入实质组织器官,使组织细胞溶解,引起细胞变性,组织崩溃渗透性增加,有利于细菌的扩散.嗜水气单胞菌的毒力因子比较多, 它们对机体的致病作用也各不相同, 但是在对机体发挥毒性作用的时候不是某一个毒力因子单独的作用, 它们还是相互协同共同作用于机体. 凌红丽等在毒素、蛋白酶及S蛋白3种毒力因子分布情况各异的6个菌株对小鼠的致死性的研究中发现毒素、蛋白酶及S蛋白均有的菌株以及具有前两者而无S蛋白的菌株对小鼠的致死率均达100%;仅有蛋白酶的菌株对小鼠致死率达60%;而只有S蛋白的,或既有毒素又有S蛋白的,或3种毒力因子均无的菌株对小鼠无致死性26. 其中无蛋白酶的菌株对小鼠无致病性,也恰恰说明了蛋白酶对毒素前体的活化作用。五、 诊断及检测技术1 鉴别培养基选择性培养基鉴别培养法是利用不同培养基成分和培养条件, 抑制多数细菌生长, 只利于某一种或某一类细菌生长的检测方法. 选择性培养基制作容易, 使用方便, 在进行未知细菌的鉴定时是比较简单而且方便的方法之一. 目前常用的嗜水气单胞菌选择培养基种类繁多,根据培养的时间来判定有GSP、SGAP、SA、SGAP-10C等,用于分离水中及食品中气单胞菌65.66 ,根据细菌生长过程中利用培养基中某些物质发生颜色变化加以区别的有RS、AHM、APM等, 由于其对嗜水气单胞菌的分辨率较高,而且判定直观, 所以在进行嗜水气单胞菌的检测和鉴定时常常使用. 但是这种方法在使用时, 温度和时间要求较严格, 培养时间较长, 精确程度值得商榷, 所以只能用于粗略的检测.2 生化试验各种细菌对营养物质分解能力不一致, 代谢产物也不尽兴同, 根据这点可以设计特定的生化反应来鉴定细菌. 在进行了初步的筛选之后对未知菌进行生化方法的鉴定也是比较快速和方便的检测鉴定方法. 因为各地菌株存在着差异,因而采用的生化试验指标的结果也有一定的差异. Carnahan等推出一种简易的鉴定方法对临床分离菌初步筛选准确率达到97%67. 马子行,等提出了精氨酸双水解( + ) ,赖氨酸脱羧酶( + ) ,鸟氨酸脱羧酶( - ) ,VP( + ) ,七叶苷或水杨苷水解( + ) , 甘露醇靛基质( + ) , 蔗糖( + ) ,纤维二糖( - ) 等9项生化指标为关键性的反应.董传甫等以革兰氏阴性, 七叶苷( + )、阿拉伯糖( + )、 氧化酶( + ) 葡萄糖产气( + )作为对嗜水气单胞菌的初步筛选指标. 杨其升认为鉴定嗜水气单胞菌比较重要的生化项目有氧化酶( + ) ,硝酸盐还原( + ) ,尿素酶( - ) ,MR( + ) ,VP( + ) ,明胶液化( + ) ,吲哚试验( + ) ,产生H2S ,葡萄糖、甘露醇产酸产气68. 陆承平认为革兰氏为阴性,氧化酶阳性的细菌,只要葡萄糖产气、发酵甘露醇、阿拉伯糖、七叶苷或水杨苷、蔗糖,鸟氨酸脱羧酶阴性等6个指标符合就可以判定为嗜水气单胞菌.3 免疫血清学技术：3.1 葡萄球菌A 蛋白协同凝集反应(SPA-CoA)SPA-COA是1974年由Kronvall建立起来的. 该技术在医学和兽医学中广泛用于细菌、病毒、寄生虫的快速诊断及病原血清型的鉴定. 其主要原理是：A蛋白是绝大多数葡萄球菌细胞壁上所具有的一种蛋白质成分. 它可与人和多种动物血清中的IgG的FC片段发生特异性结合, 而Fab片段暴露在外, 仍能保持抗体活性. 利用这一特性, SPA-COA在颗粒透明或很小, 沉淀不明显的凝集反应中起载体和放大的作用, 从而提高敏感性69. 李学勤等用SPA分别标记六株气单胞菌的特异性高免血清, 制成SPA诊断液, 建立了快速检测该致病菌的协同凝集试验, 具有快速简单、特异性较强、敏感性较高、重复性较好等优点70.3.2 免疫荧光抗体免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术. 根据抗原抗体反应具有高度的特异性,以荧光素作为标记物,与已知的抗体结合作为标准用于鉴定未知的抗原,可在荧光显微镜下检查呈现荧光的特异性抗原抗体复合物及存在部位. 荧光抗体法可以诊断抗原、检测抗体, 对抗原和抗体进行组织和细胞内的定位检测. 这种方法在嗜水气单胞菌的检测方面应用的也比较广泛, 高汉娇用直接荧光抗体法证实了鲢鱼细菌性败血症的病原菌是嗜水气单胞菌, 而且诊断速度明显快于病菌的分离与鉴定. 吴淑勤等应用间接抗体技术对鳗鲡感染的嗜水气单胞菌进行检测72. 李卫军应用间接荧光抗体技术( IFAT)对鱼类嗜水气单胞菌进行了检测. 陈昌福应用直接荧光抗体( FAT)法检测了外表健康,人工感染,自然感染和冻结保存的中华鳖的肝、脾、肾等器官中的嗜水气单胞菌的数量并且与培养法进行了比较。3.3 单克隆抗体(McAb)McAb 是指由一个B 淋巴细胞分化增殖的子代细胞产生的针对单一抗原决定簇的抗体. 此技术是1975 年由Kohlerh 和Milsten 创立的, 同时创立了生产单克隆抗体的淋巴细胞杂交瘤技术. McAb 与常规血清抗体相比, 具有特异性强, 敏感性强的特点, 这点在疾病诊断上得到了证明, 陈琼等针对致病性嗜水气单胞菌培养上清液中提取到的一种外毒素HEC, 筛选到了九株抗毒素的单克隆抗体, 其中8株单克隆抗体能特异性地抑制HEC 毒素的溶血的高活性, 用其中的1B4 株5E3 株建立DOT-ELISA 检测HEC 毒素, 从病鱼分离的95 份细菌培养上清液中检测阳性率为76%, 敏感性高于同步进行的常规血清. Delamare 等用嗜水气单胞菌ATCC7966 菌株的生长细胞免疫小鼠, 取其脾细胞与骨髓瘤细胞融合,经两步筛选,ELISA 分析表明得到的Mab5F3 能特异快速地检测出患病病人粪便中的嗜水气单胞菌.3.4 酶联免疫吸附(ELISA)及斑点酶联免疫吸附技术(Dot-ELISA)ELISA 方法是1971 年Engvall 等及Van Weemen 等继免疫荧光技术和放射免疫技术之后建立起来的一种免疫标记技术. DOT-ELISA 与ELISA 相似, 只是将固相载体反应板用硝酸纤维素膜代替, 用不溶性供体氢显色.这两种方法具有快速、灵敏和特异等优点, 在嗜水气单胞菌的检测上都得到了很好的应用. 陈怀青等应用斑点酶法检测鱼类致病性嗜水气单胞菌HEC毒素,取得了较好的研究结果,并研制出嗜水气单胞菌HEC毒素检测试剂盒,可同时检测大量的样品, 并在3-4h 内即可得出结果。钱冬等用ELISA检测细菌性败血症病原嗜水气单胞菌,对人工感染嗜水气单胞菌TPS-30 株的试验鱼的检出率可达85%, 整个过程只需1.5h 左右78. 李焕荣等建立了敏感性高、特异性强的Dot-ELISA 法检测气单胞菌的致病因子,用于快速、定性检测气单胞菌有一定作用. 刘颖等应用DOT-ELISA 技术检测了嗜水气单胞菌等鱼类致病菌,该技术重复性好, 特异性较强, 可同时检测大量的样品, 并在3-4 h 内即可得出结果。 沈素芳等在Dot-ELISA 检测胞外蛋白酶(ECPase)的基础上,研制了鱼类致病性气单胞菌诊断试剂盒. 试剂盒可在24h 内报告结果,具有敏感、特异、实用商品化的优点,可用于鱼类致病性气单胞菌的诊断. 所以这些成果说明这两种方法不失为诊断该传染病的一种快速、敏感、可靠的检测手段。4 聚合酶链反应(PCR)PCR是1985年由Mullis发明的快速扩增DNA的方法, 是一项分子生物学的新技术. 其原理是利用两个位于靶序列两端的人工合成引物, 在体外Taq酶的作用下, 提取核酸为模板, 人工合成靶序列. 重复此过程, DNA会以指数方式扩增. 此技术具有特异、快速、敏感、适于早期和大量样品的检测优点. Pollard等率先根据嗜水气单胞菌的气溶素aerA基因设计一对引物, 对具有溶血活性的嗜水气单胞菌可以扩增209bp长的核酸片段应用于临床检验. 以后陆续有研究者(Casn等、陆承平等 、夏春等、HEU等和WANG等、卢强等、Kong等、Micheal等和Gonzalez 等、储卫华等)针对嗜水气单胞菌的不同基因设计引物进行PCR检测嗜水气单胞菌的菌体, 分泌的毒素, 胞外蛋白酶等等. 但是并不是所有菌株都携带所有的基因, 也不是所有基因都与致病性相关. Micheal、Gonzlez-serrano 、朱大玲等分别发现在几乎所有的菌株中都检测到hlyA基因的存在, 但是并没有发现该基因与菌株的毒力存在相关性. 宋铁英等用PCR技术对52株不同来源和不同毒力的鳖源嗜水气单胞菌的aer基因进行了比较和分析,显示并非所有的嗜水气单孢菌都有aer基因(产生气溶素) 。所以选择菌株的保守基因而且与致病性相关的基因作为PCR的扩增对象是比较重要的. 朱大玲等发现ahpA基因的存在与菌株的毒力相关, 且该基因又与aerA基因的存在呈正相关. 因此建立aerA和ahpA双毒力基因的PCR检测方法是进行致病性嗜水气单胞菌毒力的检测的比较可行的方法, 能够比较全面客观的对该菌株进行临床的检测。六、 防止方法1 疫苗随着水产养殖规模的不断扩大及新品种的出现, 细菌性疾病不断增加。免疫是预防细菌性疾病的有效途径, 水产疫苗的数量也在不断的增加, 并开发出多联疫苗, 可以预防多种疾病。疫苗是含有病原的抗原, 能刺激动物产生抗体, 这种抗体能特异地识别消灭抗原, 为动物提供免疫保护97。水产养殖上主要有2 类疫苗, 一类是由死的或灭活的病原组成, 另一类为弱毒病原。死的或灭活的疫苗是由死的病原或病原的一些成分如细菌脂多糖或灭活的毒素组成的, 能刺激动物的免疫系统。弱毒疫苗含有减毒的活病原, 能诱导特异性抗体, 并与自然感染相似。后一类在许多国家是禁用的, 在中国是限制使用, 因为存在病原恢复毒力的风险。在疫苗中使用的抗原主要是热灭活或福尔马林灭活的细菌。浸泡免疫是鱼类疫苗中最常使用的方法,此外, 还有腹腔注射或肌肉注射、喷洒、口服98。浸泡免疫中抗原的吸收部位在鱼的侧线