现代农业生物技术对转基因.doc

现代农业生物技术对转基因（GM）植物对增强的抗虫或抗除草剂，抗逆，或营养改善方面的发展开辟了新的途径（Sthrestha，HWU，王，刘，张和，2008年）。在许多国家，转基因作物根据这些国家的标准进行安全评估，以批准用作食品和/或饲料。为了便于快速审批和风险评估在20世纪90年代早期转基因食品的实质等同性概念由联合国（FAO）和世界卫生组织（WHO）的粮食和农业组织推出。 1993年，该组织的经济合作与发展组织（OECD）制定l实质等同性性概念（Gayen，萨卡，达塔，和达塔，2013年）。比较评估的一个主要重点一直是作物组成（赫尔曼，Chassy，与帕洛特，2009年）的全面的评估。转基因（GM）作物的组成分析仍是过所有的评价中对这些材料的安全性评估的一个重要组成部分。本研究的目的是检测遗传修饰和调查比对转基因玉米与非转基因玉米含有的多个基因性状的成分分析（NK603，MON88017？MON810和MON89034？MON88017）。3、4（三种转基因介绍）草甘磷玉米（RR玉米，事件NK603）是转基因玉米耐受对除草剂草甘膦通过导入一个（EPSPS）编码5-enolpyruvyl莽草酸-3-磷酸合酶的修饰基因（EPSPS），参与莽草酸生物化学酶的产生通路，用于生产芳香族氨基酸。VT3玉米（MON88017 MON810）是玉米自交系的杂种F1 resultingfrom交叉MON810 MON88017.The混合堆叠MON88017 MON810表示threenovel蛋白：CP4 EPSPS赋予耐草甘膦theherbicide和-内毒素Cry1Ab蛋白，whichconfers抵抗欧洲玉米螟和otherlepidopterans，和Cry3Bb1，其赋予抗CornRootworm。的杀虫蛋白质的Cry1Ab，产生bythe从MON810 cry1Ab基因的基因。杀虫proteinCry3Bb1，由cry3Bb1基因产生和CP4 EPSPSprotein由CP4 EPSPS基因都从MON88017生产的。VT3 PRO（MON89034 MON88017）是玉米耐受toglyphosate基于除草剂和能抵抗鞘翅目和鳞翅目的昆虫，还含有Cry1A.105，Cry2Ab2，和Cry3Bb1蛋白。这种特定的转基因玉米中含有5种不同的转基因特性：抗鳞翅目，鞘翅目对抗草甘膦耐受性和一定量的任抗生素，对tance卡那霉素和相关抗生素的Bt毒素的两种转基因毒素。非转基因杂交玉米对照（B73？MO17）2.1玉米（玉米）样本转基因玉米样品从2011年中的所有转基因玉米样品进行现场试验采集生长在美国的推广试验（得克萨斯AM Agrilife研究与推广中心在科珀斯克里斯蒂，得克萨斯州南部，USA）的几个分开的地块。非转基因（近等基因）玉米B73MO17是从两个相关的非转基因的自交系，B73和MO17，这两者都缺乏所有的转基因玉米样品中发现的转基因元件的交叉形成的混合体，用作通过PCR进行组成分析对照。62.2. Transgenes detection by PCR2.2转基因PCR检测干种子磨碎，并储存在-20直到使用。使用的DNeasy植物小型试剂盒（Qiagen GmbH公司希尔登，德国）进行DNA的提取。的DNA的纯度和浓度，使用的是超微量分光光度计测定（2000型，Thermo Scientific，威尔明顿，DE，USA）。对每个玉米样品进行三个独立的DNA提取法进行提取。两个降压多重PCR（2SD-多重PCR）用于最佳扩增35S启动子，NOS终止子和醇溶蛋白基因的靶片段。玉米醇溶蛋白组成基因用作阳性对照。对于事件特异性引物（NK603，MON810，MON88017和MON89034），单重PCR反应被使用。 PCR测试一式三份进行。用于PCR分析所有引物序列列于表1。7、82.3Protein analysis by SDSPAGE2.3通过SDS-PAGE蛋白质分析按照Laemmli的方法（1970）进行十二烷基硫酸钠（SDS）聚丙烯酰胺凝胶电泳。玉米粉样品直接在SDS-PAGE样品缓冲液中溶解（含-巯基乙醇）并在65C加热30分钟。样品进行13000转离心以除去不溶物。每个加样控加蛋白30ug。进行SDS-PAGE分析一式两份。92.4。成分和营养分析2.4.1。近似成分和矿物质分析玉米样品的近似组分在沃德实验室测定（AOAC）的程序2005。水分含量通过在100C烘箱中干燥至恒重时损失重量进行测定。灰分通过在马弗炉中（550）焚化已知重量的样品（方法号930.05）AOAC，2005测定。粗脂肪在索格利特萃取器中经石油醚彻底提取已知重量的样品进行测定（沸点4060）（方法号930.09）AOAC，2005。蛋白质（N +6.25），通过Kjeldahl方法测定（方法号978.04）AOAC，2005。粗纤维在回流1.25的硫酸和1.25的氢氧化钠消化已知重量不含脂肪的样品后，测定（方法号930.10）AOAC，2005。干重量的碳水化合物水平估计的配方：Carbohydrates=100-（protein+fat+ash）矿物质在沃德实验室公司，使用电感耦合氩等离子体发射光谱仪（ICAP）分析。2.4.2. Amino acid analysis2.4.2。氨基酸分析氨基酸组成用氨基酸自动分析仪（：捷克共和国的AAA400国际非有限公司）进行分析。样本（100毫克）进行水解，用10毫升的6M HCl的密封管在110C的烘箱中24小时。水解后，将酸在减压下80的真空蒸发器中蒸发。该HCl游离残留物溶解在2ml的上样缓冲液（0.2M，pH值2.20），并注射到氨基酸分析仪（座Durrum，Zwerg，1958）。2.4.3。脂肪酸分析美国油化学家学会（AOCS）的Ce2-66（1997）方法用于制备脂肪酸甲基酯（FAME）。FAME准备用GC-FID带火焰离子化检测装置的气相色谱分析仪（瓦里安，CP-3800）有毛细管柱（FFAP30米分析，0.22毫米胶片的厚度，0.25毫米内径）;氦气用作载气。喷射器和检测器（FID）的温度分别保持在255和270分别与温度编程的柱为：125（0.5分钟），然后于150 Cat25/分钟（2分钟），然后于200 Cat25/分钟（90分钟）？。所述FID检测器的化妆，H2和空气流量分别为25，30和300毫升/分钟，分别。该峰被确认的基础上，它们的保留时间（Rt），使用标准的脂肪酸甲酯。102.5。统计分析用于实验的初步数据采用方差根据toSteel和托里（1981）采用方差单向分析相应的分析进行统计分析。计算机亲克软件CoStat6.311版本用来分析所有实验数据。多重上各营养素的含量的影响通过方差分析（ANOVA）进行了研究。统计学装置之间显著差异确定了适当的事后检验（P0.05）。113.结果与讨论3.1。转基因PCR检测筛选技术在食品检测中非常重要，因为它们提供了有关转基因食品（阿卜杜勒 - Mawgood，Gassem，Alsadon，Alghamdi，与阿尔多斯，2010）的存在或不存在的信息。转基因玉米的所有事件包含35S，NOS终止子或两者。因此，这些区段可用于检测玉米样品中的遗传修饰。正如图1A所示，非转基因样品仅在277碱基对，得到为醇溶蛋白的单一条带。鉴于所有三种转基因玉米样品（RR，VT3和VT3 PRO）在泳道3,4和5的35S启动子，NOS终止子和醇溶蛋白条带表明，他们分别存在于115，185和277碱基，证实它们的DNA序列存在转基因。在35S引物组的反应中，观察到约400bp的一个意想不到的带，这表明的35S引物之一有两个可能的结合位点，一是扩增预期115 bp片段，而另一个是一个约400bp的片段（Waminal，柳，财，及金，2013年）。为了证实事件的具体对每个样品的玉米，PCR分析在不同的反应进行。图。图1B，三个通用样品（RR，VT3和VT3 PRO）为阳性的CP4 EPSPS基因，这是具体的RR玉米（NK603），因为VT3和VT3 PRO是包含CP4 EPSPS在其基因组杂交。正如图。如图1C所示，两VT3和在泳道4和5 明显的带在150 bp的VT3 PRO样品，这是特定于MON810玉米中发现的Cry1Ab的基因。这些积极的结果可以看出与VT3的解释（MON88017MON810）的玉米是一个跨MON88017之间的MON810和VT3和PRO（MON89034 - ？MON88017）玉米含有Cry1A.105。 TheCry1A.105protein包括的Cry1Ab，Cry1F，和Cry1Ac蛋白（DINON等，2011）。看到inFig。在车道1D，既VT3和VT3 PRO样品图4和5呈阳性反应，Cry3Ab1基因在120bp的，因为它们含有相同的基因。看到inFig。 1E和F，VT3的PRO样品展示频带Cry1A.105和Cry2Ab2 133基点和121基点，分别。 DINON等。 （2011）报道，Cry1A.105和Cry2Ab2存在于MON89034玉米。13基于所观察到的结果，并没有在文献中所提到的，哭泣基因是转基因事件中用以达到抗虫性的最常用的基因。因此，培养引物事件的专门用于检测所有惊魂目标是非常重要的。这将使调查人员使用以矩阵为基础的方法，这些元素用于检测未经授权的转基因生物的那可能最终被用于食品，饲料，加工。3.2。通过SDS-PAGE蛋白质分析玉米蛋白的电泳分析示于图。 2，SDS-PAGE分析表明蛋白质之间的相似性高组分对所有调查样本的玉米。几个在大分子量的白蛋白和球蛋白多肽均通过SDS-PAGE分离。所有的蛋白质条带所存在的所有基因和非转基因玉米样本中。蛋白质从玉米样本出现主要的亚基的分子质量范围从15到200 kDa的组成。玉米醇溶蛋白SDS-PAGE后容易识别，并组成了主要亚基的22 kDa的所有调查样本。这一发现与罗马尼奥洛，波朗，并巴比亚乌协议（1994年），发现玉米醇溶蛋白经过SDS-PAGE很容易被识别并且包含22和24 kDa的两个主要的亚基组成。143.3. Compositional and nutritional analysis3.3。成分和营养分析转基因(GM)作物的成分分析在这些材料的安全评估程序一直是一个重要的组成部分。与传统玉米相比转基因玉米的成分是否实质上等同或有显著差异，这是一种重要的评估。在这个评估,玉米谷物测量包括近似成分分析(蛋白质、脂肪、灰分、纤维、碳水化合物、水分)、氨基酸组成、脂肪酸谱的测定和矿物质的测量。153.3.1. Proximate and minerals相似组分和矿物质相似组分是一个重要的标准来用于评估食物的总体组成和营养状况。转基因和非转基因玉米样本干燥后的相似组分如表2所示。水分是粮食保质期的一个重要的因素。低含水量有助于提高粮食的存储环境温度。在这项研究中,水分含量从10.5%到11.17%不等。众所周知,玉米谷物稳定(平衡)的水分含量应该为12%,水分含量较高的种子质量可以减少。对发展中国家的人们而言，获得足够的蛋白质是一个主要的营养需求, 由于饮食中缺乏蛋白质许多人患有各种健康问题(Nube, Boom, & Morinda, 2003)。所分析的样品中蛋白质含量有显著差异(p 0.05)。VT3 PRO样品蛋白质含量最高(12.05%)和RR样品蛋白质含量最低(8.55%)。在报道的几个玉米品种中，研究发现蛋白质在6 - 13.6%的范围内波动(雷德利et al .,2002)。同样, VT3 PRO样品相比与其他样品粗脂肪含量有一个显著的增加。非转基因，RR，VT3和VT3 PRO玉米样品粗脂肪含量值分别为3.5，3.55，3.7和4.3。这些结果与Wu等的研究结果是类似的（2006年），他发现不同的玉米品种的脂肪含量介乎3.2至6.3。要重点注意的是, 研磨谷物脂肪含量高可能会带来一个保质期的问题,导致自动氧化和酸败味(Guria,2006)。调查发现玉米样本粗纤维含量介于2.3%和2.65%之间。这些结果在文献报道中对拥有相似的遗传背景玉米范围内(1 - 2.54%)行 (Marzok,2004;吴et al .,2006)。在本研究报告中非转基因，RR，VT3和VT3 PRO玉米样品灰分含量分别为1.26，0.989，0.989和0.989。这些结果与Marzok所观察到的结果类似(2004),他发现同基因的和转基因玉米的灰分含量分别为1.30%和1.36%。糖类是一类能产生的物质，也影响玉米的使用率。，计算的糖含量有差异，非转基因，RR，VT3和VT3 PRO玉米样品分别为为84.1，84.4，82.1和80.0，。这些结果比He等所报道的要高。 （2008）。他们报告说，转基因和非转基因玉米样品糖含量为分别为77.75和77.41。此外，阿彭策尔，马利，麦肯齐，霍本和德莱尼（2009）报道，对照和转基因杂交种玉米糖含量分别为75.9和73.8。然而，这些结果在雷利等人和经合组织（2002年）的文献报道的范围内（2002年）。矿物质是需要身体组织（詹姆斯灵光，2011）正常代谢活动非常重要和必不可少的成分。四个玉米样品的矿物质含量研究结果见表2。分析表明非转基因，RR，VT3和VT3 PRO玉米样品矿物质含量水平分别为Ca（0.09，0.4，0.03和0.045），P（0.325，0.3，0.3和0.34），K（0.475，0.39，0.4和0.42），S（0.125，0.12，0.135和0.15），钠（0.03，0.03，0.03和0.03），镁（0.135， 0.12，0.13和0.13），锌（28.35，27.6，36.7和22.7毫克/公斤），铁（58.5,62.5，64.5和56.5毫克/公斤），锰（5.5，6.0，6.0和9.5毫克/千克），铜（2.4，2.05，1.8，1.6毫克/千克）和Mo（0.425，0.355，0.305，0.3毫克/千克）。样品研究中，观察到钙，磷，钠，锌，铁，锰和钼的值无显著差异，而这些样品之间观察到Mg，S和Cu含量有显著差异。这些结果类似于顿，古德里奇和Meiske（1969）提到的几个玉米品种的矿物质含量分别为（0.01-0.02）为钙，（0.35-0.47）为磷，（0.46-1.13），为钾，（0.02-0.04）为钠， 0.15-0.19为镁，（47.5-53.4毫克/公斤）为Fe和（4.6-6.1毫克/千克）为锰。此外,所有玉米样本的值在文献报道(雷德利et al .,2002) 范围内。163.3.2. Amino acids3.3.2。氨基酸所研究的玉米样品的氨基酸组成示于表3。必需氨基酸（EAA），非-GM，RR，VT3和VT3 PRO样品具有最高浓度的为谷氨酸的值分别为18.6，19.1，18.5和总氨基酸的18.3。非-GM，RR，VT3和VT3 PRO样品总氨基酸中甲硫氨酸显示为最低值分别为1.58，1.63，1.68，1.59。在检查了成对的基础上，所有的氨基酸的值是大致相似的，尽管在亮氨酸，谷氨酸，天冬氨酸，甘氨酸和丙氨酸值的一些显著差异。其它氨基酸没有显著不同。然而，这些小的差别在发表的文献正常范围水平内是不太可能具有生物学意义（雷利等人，2002）。EAA， TAA的玉米样品比率百分介于40.36 - -41.79%之间。这些值远高于被认为是足够理想为婴儿蛋白质食物的39