半定量和实时定量PCR步骤.doc

半定量和实时定量PCR步骤实验原理：RT-PCR将以RNA为模板的cDNA合成同PCR结合在一起，提供了一种分析基因表达的快速灵敏的方法。RT-PCR用于对表达信息进行检测或定量。另外，这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建cDNA文库克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。RT-PCR的模板可以为总RNA或poly(A)+选择性RNA。逆转录反应可以使用逆转录酶，以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物（GSP）起始。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行PCR。在一步法RT-PCR中，逆转录和PCR在同时为逆转录和PCR优化的条件下，在一只管中顺次进行。实验步骤：Trizol法RNA提取步骤1、提取总RNA2、逆转录反应3、PCR反应以下实验步骤仅供参考：1样品RNA的抽提取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30孵育2到3分钟。4下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30孵育10分钟后，于4下12000rpm离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4下7000rpm离心5分钟。RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40l用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80待用。2RNA质量检测1）紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。浓度测定A260下读值为1表示40gRNA/ml。样品RNA浓度(g/ml)计算公式为：A260稀释倍数40g/ml。具体计算如下：RNA溶于40lDEPC水中，取5ul，1:100稀释至495l的TE中，测得A260=0.21RNA浓度=0.2110040g/ml=840g/ml或0.84g/l取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35l，剩余RNA总量为：35l0.84g/l=29.4g纯度检测RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。2）变性琼脂糖凝胶电泳测定制胶1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60，10ml的10MOPS电泳缓冲液和18ml的37%甲醛溶液(12.3M)。10MOPS电泳缓冲液浓度成分0.4MMOPS，pH7.00.1M乙酸钠0.01MEDTA灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25l溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。准备RNA样品取3gRNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10g/ml。加热至70孵育15分钟使样品变性。电泳上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品加入上样孔。56V/cm电压下2h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少23cm。紫外透射光下观察并拍照28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖体RNA）组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。3样品cDNA合成反应体系序号反应物剂量序号反应物剂量1逆转录buffer2l5逆转录MMLV0.5l2上游引物0.2l6DEPC水5l3下游引物0.2l7RNA模版2l4dNTP0.1l8总体积10l轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。混合液在加入逆转录酶MMLV之前先70干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5l，37水浴60分钟。取出后立即95干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80待用。4梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（-actin）实时定量PCRPCR实验步骤一、组织抽提：1.取组织块50-100用液氮在研钵中研磨成粉末2.移入玻璃匀浆器加入1mlTrizol抽打匀浆3.移入1.5ml新离心管用5ml针头抽打4.冰上孵育5分钟5.离心12,000g45分钟取上清液移入1.5ml新离心管6.加0.2ml氯仿，震荡，冰上孵育5分钟7.离心12,000g410分钟取上层液相移入1.5ml新离心管8.加0.5ml异丙醇，震荡，冰上孵育5分钟9.离心12,000g45分钟弃去上清液10.加入1ml75%乙醇，震荡11.离心7,500g,4,5分钟弃去上清液12.室温下使之变透明13.加入DEPC处理水10l-35l溶解RNA（可保存在液氮或低温冰箱）14.走RNA变性电泳观察18s，28s条带，分光光度计检测260/280吸光度比值，计算RNA浓度二、RT反应体系RT反应体系（第一步）：约20分钟RNA抽提物5lRadome引物2lRNAsin0.5l1.6515分钟2.立即放入冰浴RT反应体系（第二步）：约2小时RNAsin0.5l10mMdNTP1l5RT缓冲液4l25mMMgCl24lAMV逆转录酶3l1.371.5小时2.945-10分钟3.反应物保存于-20或进行PCR三PCR反应体系1)、PCR反应体系：约4.5小时25mMMgCl22l10PCR缓冲液5l10mMdNTP1l上下游引物10pmol/l2.5l2CDNA模板2.5lddH2O34lTaq酶0.5l轻质石蜡油50l100l1.942分钟，551分钟，722分钟为第一个步1个循环2.9445秒，5540秒，721分钟为第二步30个循环3.7210分钟4.取出后45分钟后-20保存或走电泳2)、PCR反应体系：约5小时25mMMgCl23l10PCR缓冲液5l10mMdNTP1l上下游引物10pmol/l2.5l2CDNA模板5lddH2O30lTaq酶1l轻质石蜡油50l100l1.942分钟，551分钟，722分钟为第一个步1个循环2.9445