MM_FS_CNJ_0345 出口蜂产品中四环素族残留量检验方法.DOC

MM_FS_CNJ_0345出口蜂产品 四环素族 残留量 微生物牛津杯法MM_FS_CNJ_0345出口蜂产品中四环素族残留量检验方法1.适用范围本方法适用于出口蜂王浆和蜂蜜中四环素族残留量的检验。2.原理概要蜂王浆样品溶解于三氯乙酸或柠檬酸后，经离心去除样品中的蛋白质，然后用乙醚除去蜂王浆中的癸烯酸等天然抗生物质。通过色谱柱内的树脂吸附和解脱，用微生物牛津杯法进行鉴别试验，与标准比较进行定量。蜂蜜样品经溶解后，直接通过色谱柱内的树脂吸附和解脱，以下检验的操作与蜂王浆相同。3.主要试剂和仪器3.1.主要试剂乙醚、甲醇、三氯甲烷以及正已烷；甲醇溶液：60（VV）；柠檬酸缓冲溶液：pH4.0；三氯乙酸溶液：2（VV）；柠檬酸溶液：2（VV）；氯化铵磷酸溶液：称取1.0g氯化铵，吸取2mL 85，磷酸液，量取160mL 蒸馏水配制而成；氢氧化钠溶液：40（mm）；磷酸盐缓冲溶液：0.1moL L 。pH4.5，pH8.0：准确称取13.6g磷酸二氢钾置于950mL 水中溶解，用氢氧化钾或磷酸二氢钾调节至pH4.5和pH8.0，然后加水至1000mL ；生理盐水：0.85的氯化钠溶液；吸附树脂XAD2（AmberL ite，苯酚甲醛离子交换树脂）：处理方法：用甲醇浸泡30min以上，然后用水以倾析法洗涤56次，浸泡于水中备用；抗生素标准品：四环素（TC），土霉素（OTC），金霉素（CTC）。由国家卫生部药品生物制品检定所规定之标准品；抗生素标准贮备液及工作溶液：抗生素标准贮备液：准确地分别称取0.050g（精确至0.0001g）抗生素TC，OTC和CTC（其效价为1000单位mg）。各用0.01moL L 盐酸溶液溶解后并定容于50mL 。抗生素标准溶液为1000gmL 。配置后在冰箱中保存，在一周内使用。如抗生素标准品的效价低于1000单位mg（1单位1g），配制时，则换算为1000单位mg；抗生素标准工作液：在工作时，吸取抗生素标准贮备液，用pH4.5磷酸盐缓冲液稀释配制成0.05、0.10、0.20、0.40、0.80、1.0和2.0gmL 的抗生素标准工作液；色谱用的展开剂：正丁醇乙酸水415或：正丁醇甲醇水412培养基及菌种制备：菌种用培养基a. 胰蛋白胨10.0gc. 氯化钠2.5gb. 牛肉膏5.0gd. 琼脂14.016.0ge. 蒸馏水1000mL 。制备时，将上述ad各组成分加入e中，搅拌加热至溶解。于121，高压灭菌15min，最终pH为6.50.1；检定用培养基：a. 胰蛋白胨6.0gb. 牛肉膏1.5gc. 酵母膏3.0gd. 琼脂14.016.0ge. 蒸馏水1000mL 制备时，将上述ad各组成分加入e中，搅拌加热至溶解，经121高压灭菌15min，最终pH为5.80.1；试验菌种：蜡样芽孢杆菌（BaciL L us Cereus Varmycoides），菌种号63301，由国家卫生部药品生物制品检定所规定的菌种；菌种培养：将菌种安瓿瓶管的上部敲碎后，加入少量肉汤培养基，使其溶解并移至肉汤管中混匀。置于301培养24h。取菌种单个菌落接种于菌种培养基中。采用试管斜面或克氏瓶内培养，置于301培养1周。镜检芽孢菌数达到85以上，便可制备芽孢悬浮液；芽孢悬浮液制备：用适量灭菌的生理盐水洗下菌苔，于65恒温水浴中加热30min，再以2000rmin离心20min，弃去上清液，重复23次。最终用适量的灭菌生理盐水稀释，即为芽孢悬浮液，置于冰箱中保存使用。有效期为一个月；平板制备：于灭菌后冷却至5055的检定培养基中加入适量的菌液（如孢子悬浮液中的菌数在107个mL 时，则按约0.1量加入；如果106个mL 时则按约0.5加入，使0.05gmL 的TC标准液抑菌圈直径达到12mm）。混匀后，立即注入平板。每个平板直接注入检定用培养基6.0mL ，凝固后备用。3.2.仪器培养皿：内径90mm，底部平整光滑的玻璃皿，或塑料皿上用陶瓦盖；牛津杯：外径80.1mm，内径60.1mm，高100.1的不锈钢杯，重量误差不超过0.05g；游标卡尺：测量范围，0150mm，精度为0.1mm；长方形培养皿：1.5cm8cm23cm；色谱柱：内径1cm，长30cm，具有活塞调节流速；层析柱的制备：先用少许玻璃棉置于柱的底部，然后加入经处理的XAD2树脂15mL ，树脂上端加入少许玻璃棉，并用300mL 水，以150mL h流速洗柱后备用；色谱缸：20cm15cm30cm；微量注射器：10L 或50L ；半对数方格纸；离心机：转速范围04000rmin；旋转式真空浓缩器；恒温培养箱：301，隔层置玻璃板并调节水平位置；恒温水浴锅；高压灭菌器；水平台，带水平器；色谱纸：6cm20cm过滤纸；分液漏斗；氮气：纯度99.99；其他玻璃器皿。4.试样的抽取与制备4.1.检验批蜂王浆以每一生产缸（约300kg）为一检验批。蜂蜜以不超过1000件为一检验批。同一检验批的样品，应具有相同的特征，如包装、标记、产地、规格和等级等。4.2.抽样数量对蜂王浆，每一生产缸取一份样。对蜂蜜，不超过50件包装取5件；51100件，取10件；101500件，每增加100件，增取5件；501件及以上，每增加100件，增取2件。每件抽取样品不少于100g，作为原始样品。4.3.抽样工具取样器：不锈钢匙。不锈钢管，长约115cm、直径约2.5cm，或带活塞玻璃管；混样器：搪瓷桶或杯；单套杆：不锈钢制；样品瓶：100mL 、500mL 磨砂盖广口玻璃瓶。4.4.抽样方法蜂王浆：按每缸的上、中、下三个部位抽样，样品混匀后，装入样品瓶内，标明标记并及时送实验室冰箱中保存。蜂蜜：按2.2的抽样件数随机抽取，逐件开启。将玻璃取样管缓缓放入，吸取样品。如遇蜂蜜结晶时，则用单套杆或不锈钢取样管插到底，抽取样品。将所取样品倾入混样器，混和均匀，装入清洁的样品瓶内，加封后，标明标记，及时送实验室。4.5.试样制备蜂王浆样品从冰箱中取出后，在室温下融化，搅拌均匀。蜂蜜中未结晶的样品将其用力搅拌均匀，对有结晶析出的样品可将样品瓶盖塞紧后，置于不超过40的水浴中温热，待样品全部融化后搅匀，迅速冷却至室温，在融化时必须注意防止水分挥发。上述蜂王浆及蜂蜜试样均分成两份，装入洁净容器内，密封，并标明标记。4.6.试样保存蜂王浆：将试样于18冷冻保存。蜂蜜：将试样于室温保存。注：在抽样和制样的操作过程中，必须防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。5.过程简述5.1.样液提取5.1.1.蜂王浆样液提取准确称取5.0g（精确至0.1g）蜂王浆于小烧杯中，用80mL 2三氯乙酸溶液分数次溶解。定量地移入离心管中，以2000rmin离心10min。将上清液移入250mL 分液漏斗中。下层沉淀物再分别加入40、20mL 2三氯乙酸溶液搅匀后离心，合并上清液于分液漏斗中。上述上清液分别用60，60和30mL 乙醚振摇，提去癸烯酸，弃去上层乙醚，将下层水溶液收集于烧杯中，用40氢氧化钠溶液调节pH至4.5，并加入pH4.5磷酸盐缓冲溶液60mL ，备用。或准确称取蜂王浆5.0g（精确至0.1g）于小烧杯中，加入100mL 2柠檬酸溶液，摇匀后，加入100mL 三氯甲烷，振摇后移入离心管中，并以2 000rmin离心10min。弃去下层三氯甲烷，加入100mL 乙醚，充分振摇，离心后弃去上层乙醚层。再加100mL 乙醚重复一次。于留下水相中加入20mL 氯化铵-磷酸溶液，用40氢氧化钠溶液调节pH至5.0，再加入100mL 正已烷，振摇后离心。去除正已烷层，用氮气流吹除样液中有机试剂。将经上述步骤中任一种提取的试样溶液，移入装有XAD-2树脂的层析柱中，并以100mL h的流速过柱，使样液中的四环素族被吸附。四环素族被树脂吸附后，用200mL 蒸馏水洗柱，流速控制为150mL h。继用90mL 60甲醇洗脱四环素族，其流速为90mL h，并用甲醇定容至100mL 备用。5.1.2.蜂蜜样液提取准确称取约50g（精确至0.1g）蜂蜜于300mL 烧杯中，加入200mL pH4.0柠檬酸缓冲溶液，搅拌均匀，使试样充分溶解后，用2柠檬酸溶液或40氢氧化钠溶液调节溶液pH至4.5，并加入60mL pH4.5磷酸盐缓冲溶液。然后移入装有XAD-2树脂的色谱柱中，以100mL h流速过柱，使样液中的四环素族被吸附。以下操作步骤与上述蜂王浆的步骤相同。收集甲醇淋洗液于100mL 容量瓶中，并用60甲醇定容至刻度，备用。5.2.定量试验5.2.1.标准曲线绘制取5个试验用的平板，每个平板上放5个牛津杯，分别注满0.05、0.10、0.20、0.40和0.80gmL 的TC标准工作液，并于301。培养201h。然后测量各浓度的TC的抑菌圈直径，求得各自的平均值，并经回归方程校正后，在半对数纸上，以抑菌圈直径为纵坐标，TC浓度为横坐标，绘制标准曲线。每次试验时都需制备相应的TC，OTC或CTC标准曲线。5.2.2.样液的定量试验准确吸取50mL 蜂王浆的甲醇提取液于梨形瓶中；而蜂蜜仅取10mL 的甲醇提取液。在40减压浓缩至干后，准确加入5.0mL pH4.5磷酸盐缓冲液，使浓缩物被溶解。此样液中，相当于蜂王浆试样浓度为0.5gmL ，相当于蜂蜜试样浓度1.0gmL 。取5个试验平板，每个平板放4个牛津杯。每板分别注满一个0.05gmL 和一个0.10gmL 的TC标准工作液及二个蜂王浆试样提取液或二个蜂蜜试样提取液。置于301培养箱培养201h后，测量抑菌圈直径，分别求得它们的平均值。经校正后，检液的抑菌圈大于12mm时，应进行鉴别试验并按标准曲线计算出检液中的TC含量。如果检液的抑菌圈小于0.05gmL 的TC标准液的抑菌圈时，则可报告为“未检出抗生素”。试验不用进行下去。5.3.鉴别试验5.3.1.加热分解反应试验取50mL 蜂王浆的甲醇提取液，而对蜂蜜则取10mL 的甲醇提取液，置于梨形瓶中，于40减压浓缩至干。加入5.0mL pH8.0磷酸盐缓冲溶液，备作加热分解反应。取2支刻度试管，每管加入2.5mL 上述溶液，其中1支置于沸水浴中，加热30min，然后用1moL L 盐酸溶液调节2支试管内检液至pH4.5，再用pH4.5磷酸盐缓冲溶液分别定容至5.0mL 。同时于2支刻度试管中分别吸取2.5mL 0.2gmL 的TC标准工作液（用pH8.0磷酸缓冲溶液配制成），按试样提取液同样操作，最终定容至5.0mL 。取2个平板，各放4个牛津杯，每个杯中分别注入加热检液，未加热检液，加热后的TC标准工作液和未加热的TC标准工作液，然后将平板置于301培养201h，观察和测量各抑菌圈直径。在未加热的0.1gmL TC标准工作液呈现出正常的抑菌圈，而加热的0.1gmL TC标准工作液不出现抑菌圈的条件下，说明人工合成的抗生素在加热中被分解破坏。因此，未加热检液的抑菌圈直径在12mm以上，而加热检液的抑菌圈直径在10mm以下，可初步推定检液中含有TC族抗生素，并需作定性试验。5.3.2.定性试验本法采用微生物色谱法进行定性试验。用pH4.5磷酸盐缓冲溶液喷涂于色谱用纸（7cm22cm）上，自然干燥后备用。定性试验的检液的制备，如是蜂王浆试样，准确称取5.0g试样后按5.1.1中样液提取的操作步骤进行，收集100mL 甲醇提取液于40减压浓缩至干，用0.1mL 甲醇溶解。如是蜂蜜试样，按5.1.2样液的提取操作步骤进行，所收集的100mL 甲醇提取液中，吸取20mL ，置于40减压浓缩至干，用0.1mL 甲醇溶解。取TC和OTC标准工作液的浓度为2.0gmL ，CTC的标准工作液的浓度为1.0gmL ，以及定性用的试样提取液各1020g，分别用微量注射器吸取并点在上述备用滤纸上，将滤纸移放在盛有展开液的色谱缸中，展开35h后，取出。待溶剂挥发后，将滤纸轻轻贴在事先加有60mL 含有菌液的检定用培养基的长方形培养皿中，移至4的冰箱中放置1h。取出培养皿，充去滤纸，将培养皿置于301进行培养201h。根据培养皿中培养基上出现的抑菌圈的位置，测得各抗生素的Rf值。对照标准，以确定被检试样中所含TC族抗生素的种类。6.结果计算6.1.检液的抑菌圈平均直径小于0.05gmL 的TC标准工作液抑菌圈平均直径的，可以结束试验，出具结果为“未检出抗生素”。6.2.如在定量试验中，检液