以前做冰冻切片.doc

冰冻切片与漂片免疫组化以前做冰冻切片,总是遇到问题,后来查文献,自己又做实验比较,总算找到了又快又好地办法, 拿出来和大家分享一下.1. 取脑一定要在冰上操作,液体也一定用冷的2. 30%蔗糖一定要充分,最好中间换液一次, 20%的可以不做3. 沉淀后冻存,一定要快冻, 最好在干冰上操作.4. 最重要的一点, 灌注的时候, 不要用0.1M PB, 用0.01M PBS. 以前不知道,很多书上写的都是0.1M PB,后来自己用了发现还是有洞. 为了这个,我还专门作了对照实验,结果0.01M PBS更好一些, 原因不知道为什么, 但是事实如此. (理论上高浓度液体更利于保护细胞不会因为冰冻损伤)5. 如果做磷酸化的抗体,一定记得在灌注液里加一定的抑制剂,如NaF等.蔗糖俺用25%/PBS 的，不用换液，只要过夜12个小时就能沉下去了。包埋的时候不用冲洗，但是要注意一定要用吸水纸擦干蔗糖溶液，否则切片有麻烦我做切片的时候，先用20蔗糖（PB配）沉底，再用30蔗糖沉底，这样脱水比较充分。一般是等切片机温度达到-22度之后，再将包埋好的脑组织放入。脱水不充分也会导致切片有洞，而且片子容易向内卷，很不好贴。一直这样做了很久，效果都还不错。取脑后，直接投到液氮？我试过，由于脑组织水分多，下液氮后直接就碎了防止脑袋冻碎办法：先准备好一个保温杯，倒入适量的液氮，然后在杯身中放一个纸杯（塑料或玻璃杯禁用），再在杯中放一金属片，以防止纸杯翻倒，动物脑袋取好后，先放在一张小锡箔纸上，然后连锡箔纸一起转移至杯中的金属片上面，盖上保温杯盖，3-5分钟后，见大脑表片颜色变白，表示冷冻完全，随即将大脑用锡箔纸包好，转入-80度冰箱长期保存。脑片切好后保存方法：1、先用手指在玻片（已挂好胶）后均匀轻轻过一下，将脑片组织贴在玻片上。2、37度干燥箱中烘干。3、放入切片盒中，盖紧盒盖，并用胶带将切片盒封严，外用样品袋包扎严实，即可防止水汽进入。于-20度可保存半年以上，于-80度可保存一年以上。切忌经常打开盒子。想请问0.01M PBS的配方，谢谢！0.01M PBS配方（pH7.27.4）（500 ml）Na2HPO412H2O2（分子量358.14） 2.9gNaH2PO42H2O2 （分子量156.01） 0.295gNaCl 4.5gddH2O 500 ml混匀，完全溶解后，用H3PO4调PH值至pH7.27.4。用前配制或者于4度短期保存。用Google搜了一下发现网上很多0.01M PBS配方是：NaCl 8.0g ； KCl 0.2g ； Na2HPO4 1.44g ； KH2PO4 0.24g ；加蒸馏水 至 1000ml，调节pH 到 7.4（pH 有用Na2HPO4或KH2PO4调节也有用HCl调的）需要注意的是，通常所说的浓度0.01M 指的是缓冲溶液中所有的磷酸根浓度，而非Na 离子或K 离子的浓度，Na 离子和K 离子只是用来调节渗透压的。我计算了下两种配方磷酸根浓度都在0.01M ，而jmfan的配方浓度更精确些，但是发现其配方中没有钾离子，不知道会不会在渗透压上有影响？另外对调PH的问题，我们一直都是用HCl调的，没有用过H3PO4或其盐，有没有大虾对这方面清楚的呢？其实PBS的配方的确有很多，不尽相同，这里所说的PBS就是指磷酸钠盐缓冲液，当然还有磷酸钾盐缓冲液，即KPBS，我做IHC时是用磷酸钠盐缓冲液的，这2者对实验影响应该不是很大。楼主可以查一些与你检测指标相关的文献，在文献的实验方法中，会注明是用磷酸钠盐缓冲液还是用磷酸钾盐缓冲液的。至于调节PH问题，一般是用与缓冲液相对应的弱酸根离子或弱碱性离子来调节的，所以调PBS的PH时理所当然是H3PO4来调节的，当然用HCL或盐也可以的，但不常用的，并且HCL是强酸，挥发性，稍不小心就很容易调过的还有一点就是：我给你的那个配方，如果水的PH值没有问题的话，按相应质量的溶质配好后的PBS的PH为7.3左右，所以可以不用调PH即可用，楼主可以试试看严格地说PBS指配方：0.01M PBS配方（pH7.27.4）（500 ml）Na2HPO412H2O2（分子量358.14） 2.9gNaH2PO42H2O2 （分子量156.01） 0.295gNaCl 4.5gddH2O 500 ml引用中的这个配方（NaCl 8.0g ；KCl 0.2g ；Na2HPO4 1.44g ； KH2PO4 0.24g ；加蒸馏水 至 1000ml，调节pH 到 7.4）是1X DULBECCOS PHOSPHATE BUFFERED SALINE (PBS) WITHOUT CALCIUM, MAGNESIUM，注意，是Dulbecco改良的配方，简称D-PBS，还有含钙镁的配方，例如从INVITROGEN订的Dulbeccos Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (10X) liquid Contains calcium and magnesium. PBS - Phosphate Buffered Saline Formulation(HyClone):厂家的配方跟名称都很严谨我实验样品冰冻切片厚20微米，很巧的是，我做的是膜受体蛋白。一般来说，切片薄一点比较好，染色清晰，细胞形态可能要明显一点，但是有可能难以观察完整的单个细胞，因为可能刚好切到细胞体了，还有薄片切片时比较难切，后来我看了一些文献，有14微米的，20微米的，30微米的，甚至还有40、50微米的，文献上的说法也不一，我想这可能与检测蛋白的分布、特性以及丰富度等有关吧，我20微米后的切片染色结果不错，不过我没切30微米的做比较，呵呵讲一下制作的技巧制作切片时，组织进行冷冻时，必须在组织的上、下方加入适量的OCT。形成组织上、下方有一定的边，进行切片时，应将组织大面放在横位，这样可以避免组织切片时皱缩。切好的片必须跟组织相似，要避免因切片不完整造成医生漏诊。 贴附组织时手不能颤抖，而且在贴附组织时手要有一个向下伸展的动作。取材时刀片要锋利，应从刀柄处拉切到刀尖，忌采用切割式切取，镊取组织块要用无齿镊、动作轻柔、避免挤压等。你切片是连续放24孔板吗？如果是的话，能否谈谈切玩以后怎么选择脑片做组化的？就是说假如要选取某一个或几个位置的脑片（ eg, bregma -1.2, 0.8, 2.2, ect)，具体应该怎么做能选的比较准?我切下来放入12孔细胞培养板板（有保护液，参照我的另一个帖子，可以搜索到）保存，需要染色时就拿出一个孔来做free floating。切片的放置顺序是从A1，A2，A3.B1，B2.C4，第一轮放完后（每孔一片），继续从A1开始放入至C4，染色时就取一个孔的全部片子出来，每一个孔就是一套全脑的切片，如果你的切片厚度是30um，那么每套片子的层面距离就是30um12，你也可以放10张片子，再重复放置。这样的话，每套片子是30uMX10。你也可以切20，40，50uM，根据自己的要求。关于定位，必须参照动物的解剖图谱。你可以拿出一套片子，作CV染色，这套片子以后就是你的标准参照了。CV染色之后，很容易你就能区分不同的区域，以后你就知道哪一个孔里大概是什么位置。你们在孵育一抗，二抗，ABC 时是在哪里？我为了省抗体，放在了1.5 毫升离心管里。然后37度孵育一个小时。我用毛笔捞片子总粘毛笔，怎么回事？显色是在培养板里。可以用接种细菌用的“金属丝”弯曲成一个“p”形状，用于捞片，由于这种金属丝弹性较好，使用起来感觉不是那么死板，基本上不会损伤脑片。我孵育抗体一般也是在ep管中。我们在免疫组化过程中捞片都是用一个玻璃吸管弯成的小钩钩来挑的，毛笔只有在最后把片子铺在载玻片上的时候才用。洗片的时候都是在24孔板，有时候孵育的时候也用1.5ml的EP管。主要是看抗体的稀释度，如果稀释度很高，不需要减小液体体积来节省抗体的话，也用24孔板来孵育。1.我是先用生理盐水心脏灌注，后改为用0.01MPBS配置的多聚甲醛灌注,各150ml(大鼠).2. 4%多聚甲醛浸泡1夜；先沉20%蔗糖，后沉30%蔗糖（用0.1M PB配制），20%的蔗糖沉底即可，我们的经验是30%蔗糖多沉几天，否则切出的片子很脆，容易形成细条状。3. 为了防止切片有空洞，切之前液氮速冻1min，冰切机（-22）15min后再切片。我们以前没有液氮速冻，切出的片子全是空洞。3、用PH7.2的PBS灌注脑组织（以大鼠为例：一只大鼠用200ml灌注液）。4、然后再用0.9%的生理盐水 灌注冲洗（200ml）。5、断头取脑。6、用2530%遮糖浸泡1216小时。取材，切片。但切片前一定用滤纸将遮糖吸净。7、冰冻切片机的温度分二步。箱内温度是20度，刀座温度是16度。8、为了不脱片可以在清洗好的玻片上涂上多聚赖氨酸。9、如果是作免疫组化有另外的处理方法。首先就是捞片的方法，感觉太费劲。用楼主的方法还必须用吸管吸水，其实我一直用的方法是用针灸针做成的捞片，这样一张一张的将片子捞到24孔中，非常迅速，而且有水的存在不会损伤了标本，楼主的做法很可能损坏了标本。其次，此贴片方法比较繁琐，毛笔可以换成勾线笔，贴片在培养皿中进行，先在培养皿中倒满PBS（最好不要用水等），将载玻片一头放于皿底，一头搭于皿边上，形成一个倾斜的角度，将切片用针灸针（做成的捞勺）捞片于培养皿中（这样全程都在水中操作保护标本），用勾线笔笔头轻轻拖住标本的一边（借助水的吸附力拖动标本，这样标本在水中不容易出现皱着和破损），将标本拖到载玻片上合适的位置，笔头一转，脱离标本，而且多余的PBS会顺着培养皿的PBS液流入培养皿，这样的话标本留下的水会很少（这一点很重要，显微镜下看片的时候就知道为什么了）！切片是大鼠脊髓，数量在10张左右，因为孔体积小，面积越大的切片数量要越少。盒子里是海绵。板子是找厂家做的。吸管要加大口径，还要用酒精灯烧一下。把贴片的链接补上了。曲拉通-100，现在我只是在封闭液里加，有个体会给大家说一下，我把封闭液1毫升分装好，用前再用枪头加3微升曲拉通，曲拉通因为是油性的，枪头外壁上很容易沾上，这样加到封闭液里的量就比较多，造成染色失败。现在我是用纸把