实验项目一猪骨髓间充质干细胞的分离和培养.doc

猪骨髓间充质干细胞的培养与分离实验准备： 器材：手术刀片，手术刀柄，剪刀，镊子，弯钳，5ml灭菌注射器，7号注射针头，10ml离心管，离心机，100mm培养皿，75ml培养瓶 试剂：低糖DMEM（含有10%FBS,75g/ml青霉素，50g/ml硫酸链霉素） 1000iu/ml青链霉素的PBS（生理盐水）(装入灭菌的洗瓶中) 无血清低糖DMEM. 2%台盼蓝染液材料采集： 一，胎猪骨髓采集： 【1】 1，无菌条件下从猪子宫内取出胎儿置入到保温瓶中，加入含有青链霉素的PBS或生理盐水中，立即送回实验室。 2，在无菌操作下取下左右股骨，除净肌肉、骨膜及股骨两端软骨组织；用PBS冲洗3-4次用灭菌生理盐水冲洗干净，在超净工作台内剥离肌肉和骨膜，得到完整的股骨。立即用含有1.0ml DMEM+3000iu/ml肝素的注射器冲骨髓腔，迅速换上5号的针头将冲出的骨髓血轻轻吹打，再加入等量培养液（DMEM+10%FBS）稀释，然后以1:4比例缓慢加入到Percoll分离液（1.073g/ml）的表面，1000r/min 30min,小心吸取乳白色的有核细胞层。目前用于分离MSCs的方法主要有密度梯度离心法，流式细胞仪分离法和贴壁筛选法。密度梯度离心法目前主要包括利用percoll分离液分离MSCs和利用淋巴细胞分离液分离MSCs两种。Percoll密度梯度离心法根据细胞密度不同将细胞分为数层，因此得到的MSCs纯度较高，但是操作繁琐，而淋巴细胞密度梯度离心法虽得到的MSCs不及percoll密度梯度离心法得到的细胞纯度高，但是操作简单，且获得的MSCs增殖活性较强。 【13】来自:胎猪骨髓间充质干细胞核移植及核移植胚胎干细胞的分离 取2-3月龄猪胎儿，在无菌操作下取下左右股骨，用含1000iu/ml青链霉素的PBS浸泡30min,除净肌肉、骨膜及股骨两端软骨组织；用PBS冲洗3-4遍；用吸有4ml -MEM细胞培养液的一次性无菌5ml注射器刺入处理好的股骨的一端，冲出骨髓，然后用7号针头轻轻吹吸数次，使冲出的骨髓尽可能分散为单个细胞，100目滤沙过滤；1000rpm/min,离心5min,用-MEM细胞培养液制成细胞悬液，计数后，调整有核细胞的密度为1-2x107/ml.,然后接种培养。 二，新生小型猪骨髓采集： 【9】 采取全骨髓培养法和密度梯度离心法进行pMSCs培养。根据动物体重，将幼猪麻醉。用10ml规格注射器抽取2ml肝素钠（200iu/ml）在无菌条件下，抽取1日龄猪髂后上嵴骨髓10ml,取5ml在1500r/min离心5min,细胞沉淀重悬在加入双抗的4ml生理盐水中，1500r/min离心5min,最后细胞重悬在完全培养液（DMEM+15%FBS）中，将密度5x 104/cm2的有核细胞接种到一次性塑料培养瓶中，置饱和湿度、37、5%CO2培养箱中培养。另5ml加入15ml离心管中，加入5ml DMEM稀释后，缓慢加于密度为1.077g/ml 5ml淋巴细胞分层液（天津TBD）上，1500r/min 15min,缓慢吸出分层后的界面单核细胞层pMSCs,置于完全5ml培养液中，离心一次，取沉淀细胞接种到培养瓶中，置饱和湿度、37、5%CO2培养箱中。24h分别观察贴壁情况，48h后换液。以后每三天换一次液，细胞长至汇合度80%时，1:2传代，并冻存备用。 三，成年猪骨髓采集：【2】 氯胺酮15mg/kg肌注麻醉，根据麻醉情况进行追加麻醉以50mg/kg量。手术区域进行去长体毛，用16%Na2S进行脱毛。碘酊消毒，酒精脱碘。将3000iu/ml肝素0.5ml注入离心管中，预湿管壁。蒲无菌洞巾，骨穿针刺髂后上嵴，待有突破感后，拨出针芯，换上10ml无菌注射器，抽取骨髓2ml并迅速将抽得的骨髓推入肝素预湿管壁的离心管中。按照说明书进行细胞分离。【3】【4】 取6头体重50kg的3月龄雌性长白猪，肌注25mg咪达唑仑和200mg氮氨酮麻醉诱导与静脉推注50mg氯胺酮复合麻醉，在胫骨近端采用骨髓穿刺针穿刺抽取约15ml骨髓，置于肝素化试管内。将每6ml骨髓加入到含有4ml的ficoll-paque plus分离液（1.077g/ml, Amersham公司，美国）离心管中。室温下400g, 30min.收集中间层的有核细胞。PBS稀释，100g离心10min，共2次，悬于DMEM计数。然后以1x107接种到75cm2塑料培养瓶中，加入12ml10%FBS的DMEM,37，5%CO2培养。【5】 无菌条件下，用注射器吸取4ml含有1000iu肝素的无血清培养液，抽取小型猪股骨骨髓3ml,1500r/min离心5min,细胞重悬于4mlPBS中，密度离心获取MSCs,最后细胞重悬于培养液中，将密度5 x105/ml的有核细胞接种到一次性塑料培养瓶中，置饱和湿度，37，5%CO2培养箱中培养。2天后半量换液。在细胞接近融合时，用0.25%胰酶消化，以1:2传代培养。【6】【7】 全骨髓培养法分离培养PMSCs出生1日龄的幼猪麻醉，用10ml规格注射器抽取2ml肝素钠（200iu/ml）在无菌条件下，抽取1日龄的猪髂后上嵴骨髓10ml.取5ml于 1500r/min 5min,细胞沉淀重悬在加有双抗的4ml生理盐水中，1500r/min, 5min .将细胞重悬到含血清的完全培养液中，以密度5x104个/cm2的有核细胞接种到一次性塑料培养瓶中，37，5%CO2. 密度梯度离心法分离培养PMSCs, 将另外的5ml加入到15ml离心管中，加入5mlDMEM稀释后，缓慢加于密度为1.077g/ml 5ml淋巴细胞分层液中。 1500r/min 15min,缓慢吸出分层后的界面单核细胞层PMSCs,然后置入到完全培养液5ml中，离心一次，取沉淀细胞接种到培养瓶中。观察，换液。密度梯度离心法分离的pMSCs相对较纯，24h贴壁细胞量相对较多，细胞形态呈短梭形或三角形，少数呈多角形，且有长短不等的细胞突起。48h首次换液，见贴壁细胞开始分裂增殖，部分区域形成细胞团簇。7天后，细胞形成分散的成纤维集落，集落中的细胞不断扩增，呈放射状向周围扩展。14天长满。传代后2-4h迅速贴壁，10h大部分贴壁。【8】 骨髓单个核细胞分离 选取25kg中华小型猪，以氯胺酮(25mg/kg)和地西泮（1mg/kg）肌肉注射进行全身麻醉，在无菌操作下于髂前上嵴2-4个部位，以含肝素盐水的50ml注射器抽取骨髓30ml（含肝素12500iu）。 加等体积PBS稀释骨髓提取液，以吸管吹打分散细胞，按1:1比例小心将骨髓稀释液转至配好的percoll分离液(1.077g/ml,pharmacia)上面，在调温低速离心机中，4条件下离心（800g 30min）.离心后在离心管中形成四相，由上而下依次为血清相、单个核细胞相、percoll分离液相、红细胞血小板沉淀相。其中单个核细胞相介于血清和分离液之间，呈薄薄一层絮状。在上层血清和中层的分离液交界处小心吸取单个核细胞，PBS洗2次(400g 10min/次)，随后以DMEM培养基稀释后将密度调至5x105/cm2,接种到75cm2培养瓶中，置入37、5%CO2饱和湿度培养像中培养。 【10】材料：健康小型猪，6-7月龄，雌雄不限，体重16-21kg,由昆明医学院实验动物中心提供。实验方法：获取骨髓 3%戊巴比妥钠按1ml/kg沿猪耳静脉缓慢推注麻醉后，将猪以侧卧位置于无菌操作台上，碘消毒后铺洞巾，用20号骨穿刺针在髂前上棘进针，穿入髂骨骨髓腔，接20ml注射器（肝素化），匀速抽取骨髓液，避免间断。去除穿刺针后在穿刺点周围注射青霉素，将猪送回猪笼。 直接贴壁法的原代细胞培养 抽取骨髓液5-6ml,放入含有2-3ml肝素的50ml离心管，同时适当振荡离心管，以利于肝素和浓稠髓腔血迅速混合，防止小型凝血块的出现，之后再加入等体积生理盐水，吸管轻轻吹打混匀制成细胞悬液。800r/min 8min,上层可见脂肪细胞层，用吸管轻轻吸去该脂肪细胞层，将剩余的细胞反复吹打混匀，在另一支无菌离心管内加入DMEM培养基，内含10%新生牛血清。将细胞吸到此离心管中反复吹打混匀，直接接种到6孔板中。 密度梯度离心法结合贴壁培养法的原代细胞培养。同上方法制备细胞悬液后，按1:2的比例将细胞悬液轻轻沿离心管壁加入比重为1.077g/ml的Ficoll分离液。2700r/min 离心30min后，取出时液体呈3层，用弯吸管轻轻垂直伸入液体中层，沿管壁吸取含云雾状细胞的淡黄色液体层，移至一无菌的离心管，加入等体积的生理盐水，1500r/min离心15min,以清洗Ficoll分离液，弃掉上清，留管底白色细胞团。再用生理盐水以800r/min离心清洗两遍。向离心管内加入DMEM培养基，内含10%新生牛血清。反复吹打制成单细胞悬液，将细胞以1x 106的浓度接种到6孔板中。培养板置于5%CO2饱和湿度，37培养箱中培养。72h后首次换液，弃掉未贴壁的细胞，以后每隔2-3天换液1次，直至细胞长成单层。注意事项：直接贴壁培养法通过离心获得的细胞混有大量的红细胞。原代细胞培养时，有大量红细胞沉积影响间充质干细胞贴壁，故于24h和48h后轻轻晃动培养板减少沉积的红细胞，以利于更多的骨髓间充质干细胞能够贴壁，培养成功的细胞形态与密度梯度离心结合贴壁培养的细胞形态镜下观察无差异；但是对于第二种分离方法在24h部分细胞贴壁，绝大多数呈圆形，仍有较多单个核细胞悬浮，故72h后在首次换液，基本可使贴壁细胞完全贴壁。在接种7-9天已有部分细胞开始分裂，形成细胞集落，15-17天后细胞扩增进入停滞期，细胞集落达到80%以上融合，此时可以传代，约7天长满。 【11】 西藏小型猪3只，年龄4-6个月，体重15-25kg均为雄性。动物麻醉后，无菌条件下，从双侧髂前上棘各抽取骨髓5ml,加等量生理盐水充分混匀后1000rpm,5min弃上清，将离心后的骨髓细胞沿离心管壁缓慢加入装有ficoll液（比重1.077）的离心管，1500rpm,30min收集中间絮状的单个核细胞，离心洗涤一次后接种到25ml培养瓶，37，co2培养箱中。48h换液去除未贴壁细胞。【12】 来自：猪骨髓间充质干细胞体外诱导构建组织工程化软骨 选取小型猪6只，雌雄不限，体质量15-20kg,将骨髓穿刺针接20ml注射器（内含3000u/ml肝素0.2ml）,在无菌条件下抽取胸骨骨髓约6-8ml,经低糖改良eagle培养基（DMEM）稀释后，与percoll液按1:1的比例进行梯度离心，1000r/min,离心20min,吸取中间的单个核细胞层，磷酸盐缓冲液洗2次，以2x105/cm2的密度接种到25cm2培养瓶中，加入DMEM-LG完全培养液，包括：青霉素100iu/ml,链霉素100g/l,丙酮酸钠100mg/l,谷氨酰胺、体积分数为0.1的胎牛血清，在37，5%CO2培养箱中培养，4天首次换液，换液2次/周。12-14天后基本长满单层，用胰蛋白酶（0.5g/l胰蛋白酶，0.2g/LEDTA）消化，以1:3进行传代培养。 【14】从成年健康小型香猪(由解放军军事医学科学院提供髂骨抽取骨髓，F-12培养基（Hyclone）无菌条件下充分混匀，加入到密度为1.077的Ficoll-Paque分离液（Pharmacia）,400g,离心30min,收集单核细胞层后，F-12洗涤2次，按1x109/l密度接种到F-12培养液(含有10%胎牛血清，100g/ml青霉素 100g/ml链霉素)中，37，5%CO2，饱和湿度条件下培养。24h后换液，弃去未贴壁的细胞，每隔3-4天换液，倒置显微镜下（leica）观察细胞生长状况。 【15】骨髓间充质干细胞的培养与鉴定 5ml肝素化（0.5ml肝素）的骨髓标本加入10ml的PBS,室温下以900g离心10min两次，弃脂肪和上清液，洗涤后的细胞以PBS制成4x107细胞数/ml的悬液，取5ml小心地叠加到5mlpercoll分离工作液（1.073g/ml）上，1100g离心30min,在界面取单个核细胞层，加2倍量的PBS,900g离心5min,弃去上清，以1x106细胞数/cm2的密度接种到培养瓶中，加入DMEM-LG培养液（含10%胎牛血清，100iu/ml青霉素，100g/ml链霉素），置入37，5%CO2的饱和湿度的CO2培养箱中，24和72h各换液一次，以后每3-4天换液。待贴壁细胞达到80-90%融合后用0.05%胰酶和0.53%mMEDTA室温消化，以1:3的比例传代。细胞在接种后24小时，出现大的圆形细胞，发亮。48-72h后呈纺锤形、梭形、多角形，增值迅速，原代培养约14-20天左右可达到80-90%融合。传代细胞24小时内完全贴壁，5-7天内达到80-90%融合。【16】来自：2010-骨髓间充质干细胞可以刺激心肌细胞增殖分化。 从髂骨脊多点抽取骨髓，然后将抽出的骨髓通过密度梯度离心，最后收集分层细胞并接种到25ml含有10%FBS（Hyclone, logan,UT）-MEM培养基的162 cm2培养瓶中（Fisher scientific, Pittsburgh,PA）.在接种后5-7天在换液期间将未贴壁的细胞冲掉，剩下的贴壁的纯化的细胞继续培养扩增。接着将获得的MSC细胞按照说明书，用绿色荧光蛋白（lenti-GFP vector, lentigen）进行转导。将被标记的细胞进行冷冻保存，要求细胞在80-90%的汇合度第五代。细胞冷冻液包括10%DMSO,5%猪血清白蛋白，以及85%plasmalyte.将细胞置入到冷沉淀袋子中，以5-10minllion MScs/ml,冷冻到-180。在解冻使用前，先用台盼蓝染色观察细胞活力要求大于85% 【17】来自：2006猪骨髓间充质干细胞的分离鉴定，基因调整以及核的重编程 用11-G biopsy-aspiration needle(medical device technologies,inc)连接到一个肝素化的注射器上，在肱骨头处吸取20ml骨髓。将洗涤后的单核细胞通过polysucrose and sodium diatrizoate (Histopaque; density, 1.077;Sigma)离心分离，即将5ml的DPBS与采集的3ml骨髓液混合后加入到15ml离心管中。然后将细胞悬液加入到3ml的Histopaque上，在室温下400g 30min离心。然后用一个巴斯德吸管吸收离心分层不透明的界面物，之后用DPBS冲洗两次。洗涤之后，单核细胞用含有10%FBS的-MEM重悬，并以500000 cells/cm2接种到培养瓶中。24h后，未贴壁的细胞被冲洗，将粘附的生长类似成纤维样的细胞继续培养10-14天，每三天更换一次培养基。细胞生长到80-90%汇合度时，用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液进行传代，以5000-6000cells/cm2/cm2接种到塑料培养瓶中。最终结果：每次骨髓吸取液（20ml）经过密度离心后获得的单个核细胞密度为2.330.5 x108,这个数目足以接到到六个75cm2培养瓶中。在接种24-48小时期间绝大多数未贴壁细胞在换液期间被洗掉。在最初接种4-5天后，许多不连续的成纤维细胞样的克隆表现较为明显。绝大多数细胞表现为具有成纺锤形特征，然而其他细胞具有多角形特征。在接种后第10-15天克隆的数目及大小逐渐增加到80%的汇合度。 【18】来自：2006-用akt转导的间充质干细胞在猪心肌梗塞模型的作用： 从猪的髂骨脊处吸取10-20ml的骨髓，然后将骨髓进行肝素化处理，迅速拿到实验室在800g,10min室温条件下进行离心，然后丢弃上层血清层，将沉淀细胞以1:1与PBS进行混合，然后将其置入到等体积的Lymphoprep(1.077g/ml,Technoclones)上，然后在800g 30min进行离心。然后收集梯度界面之间的云雾状的单核细胞。将收集的分层细胞用PBS冲洗两次（300g,5min,室温），冲洗后将沉淀细胞重悬以2x105密度接种到含有10%FBS的L-DMEM（Gibco）中。然后将细胞培养在375% CO2条件下，在接种后5天内未贴壁的细胞被移除。培养基每3-4天更换一次，在大约7天之后，分离得到的MSCs克隆株较为明显。然后对细胞进行消化处理，并重新以8000cell/cm2细胞数接种传代。 【19】来自：2003猪骨髓间充质干细胞的分离培养及分化潜能的鉴定 从成年健康小型香猪髂骨抽取骨髓，F-12培养基（Hyclone,USA）在无菌条件下充分混匀，加入到密度为10.77g/l的Ficoll-Paque分离液（Pharmacia,USA）中，400g离心30min,收集单核细胞层后，并以F-12洗涤2次，置沉淀细胞到F-12培养液（含有10%胎牛血清，100x104iu/l青霉素，100mg/l链霉素）中。调整密度为1x109/l的密度接种，培养，24h后换培养液，弃去未贴壁的细胞，每隔3-4天进行换液，倒置显微镜下见识细胞生长情况，接近融合的MSCs用0.25%胰酶消化5-10min,180g ,离心10min,弃去上清，按照1;3比例传递啊。留取第三代。接种后24h体外培养后少量贴壁细胞，弃去悬浮细胞后继续培养，在第4天内呈相对静止状态，之后细胞生长速度加快。呈克隆梭型，12天左右达到融合，细胞形态均一。【20】 来自：成年人骨髓间充质干细胞分化为心肌源性性细胞的研究 材料：L-DMEM, FBS, HS(horse serum) 均购买于Gibco(Grand Island,NY)。Amphotericin(两性霉素),5-azacytidine（5-氮胞啶），Tyrodes 平衡盐溶液，Bfgf, 胰酶-EDTA,鼠抗人的肌间线蛋白抗体，beta-MHC, alpha-心肌肌动蛋白抗体均购买于Sigma(st,Louis,MO).FITC共轨的鼠抗人抗体（CD3、CD14、CD33、CD34、CD45、CD71、HLA-DR）,PE共轨的鼠抗人抗体（CD13、CD29、CD38、CD-44）,FITC共轨的鼠 lgG1,以及PE共轨的鼠lgG1均从Becton Dickinson(san Jose,CA)购买。有关试剂盒以及逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)均购买于Invitrogen(Carlsbad, CA). 有关引物由上海生物工程公司（shanghai bioengineering company）. 人的MSCs的分离：骨髓从健康者的臀部的髂骨脊抽吸，收集管中加入肝素6000iu,在1100g,30min条件下，将细胞悬液通过1.073g/ml Ficoll进行分层离心，收集分层后的单核细胞。将收集的细胞用PBS冲洗两次，然后以2x105/cm2接种到完全培养基中（L-DMEM,10%FBS,5%HS,100iu/ml青霉素和链霉素），在37，潮湿的5%CO2培养箱中。三天后，将未贴壁的细胞（造血细胞）通过换液移出。在培养10天后贴壁的细胞形成均匀的克隆。此时用胰酶消化后使贴壁细胞发生重悬，然后以8000/cm2浓度重新接种到新的培养皿中（大约为1:3传代），培养基每3天换液一次，从第二代的MSCs开始用于分化的研究。在原代细胞培养第3天后，MSCs贴壁到塑料表面，表现出一定数量的单个细胞。细胞表现为具有一个核的纺锤形细胞原代培养的第7天-第10天，细胞表现为长的纺锤形类似成纤维细胞，并开始形成克隆。21，来自：不同年龄的鼠骨髓间充质干细胞的特征描述 鼠用氯胺酮（40mg/kg）和甲苯噻嗪（