2014年分子生物学硕士生复习题答案.pdf

2014 年分子生物学 分子遗传学 硕士生复习题年分子生物学 分子遗传学 硕士生复习题 1 阐述你对基因概念的理解和诠释 阐述你对基因概念的理解和诠释 答 从分子生物学的角度 可以把基因定义为 能够表达出一个有功能的多肽链或功能 RNA 分子的核酸 序列 这里的 RNA 分子是指 rRNA 和 tRNA 核酸序列主要指 DNA 对于 RNA 病毒来说则指染色体 RNA 这个定义较确切地表述了基因的本质和功能 现代对基因理解的发展表现在如下方面 1 孟德尔的遗传因子 孟德尔在豌豆试验中提出了遗传因子的概念 认为生物的每一个性状都是由遗传 因子来传递的 遗传因子是一些独立的遗传单位 遗传因子作为基因的雏形名词诞生了 2 基因 染色体上的遗传功能单位 1909 年约翰逊提出基因 gene 这一名词 表示遗传的独立单位 摩 尔根首次完成了当时最新的基因概念的描述 即基因以直线形式排列 它决定着一个特定的性状 而且能发 生突变并随着染色体节段的互换而交换 它不仅是决定性状的功能单位 也是一个突变单位和交换单位 3 顺反子 一个基因一条多肽 1957 年 本泽尔以 T4 噬菌体为材料 在 DNA 分子水平上研究基因内部 的精细结构 提出了顺反子学说 认为基因是 DNA 分子上一段核苷酸序列 负责遗传信息的传递 一个基 因内部仍可划分为若干起作用的小单位 即可区分为顺反子 突变子 重组子 4 操纵子 遗传信息传递和表达调控的统一体 1961 年雅各布和莫诺提出大肠杆菌乳糖操纵子模型 根 据基因功能把基因分为结构基因 调节基因和操纵基因 能编码多肽链的基因称为结构基因 启动基因 操 纵基因和编码阻遏蛋白 激活蛋白的调节基因属于调控基因 操纵基因与其控制下的一系列结构基因组成 1 个操纵子功能单位 5 移动基因或转座元件 基因并不是完全固定在染色体的一个位子上 某些 DNA 片段 转座子 能在 有机体的染色体组内从 1 个地方跳到另一个地方 它们能从 1 个位点切除 然后插入同一或不同染色体上的 另一个位置 基因的跳动能够产生突变和染色体重排 进而影响其他基因的表达 6 断裂基因 内含子和外显子 对真核生物核苷酸序列中间插入有非编码的 DNA 间隔区 内含子 使 1 个基因分隔成不连续的若干区段 这种编码序列 外显子 不连续的间断基因被称为断裂基因 7 重叠基因 随着 DNA 核苷酸序列测定技术的发展 人们已经在一些噬菌体和动物病毒中发现 不同 基因的核苷酸序列有时是可以共用的 它们的核苷酸序列是彼此重叠 这样的 2 个基因被称为重叠基因 它 修正了关于各个基因的多核苷酸链是彼此分立 互不重叠的传统观念 8 染色体外基因 这类基因存在于染色体外 它们的传递不符合孟德尔的分离和自由组合定律 如线粒 体基因 叶绿体基因等 它们的基因编码细胞中专一的蛋白质并自我复制 9 管家基因和奢侈基因 同一个体内细胞具有相同遗传信息 但基因表达各不相同 有些基因的表达是 维持细胞生命活动所必须的 称为管家基因 有些基因在不同细胞或组织中特异性表达 称为奢侈基因 由此可见 随着生物科学的不断发展 人们对基因概念的理解也不断深入 在世界科学技术日新月异的 今天 生物科学将会有更多新的突破性进展 基因的概念不可避免的将会被赋予新的内容 2 举例解释蛋白质二级结构 超二级结构举例解释蛋白质二级结构 超二级结构 MOTIF 三级结构 三级结构 DOMAIN 和四级结构 和四级结构 答 1 蛋白质的二级结构 指多肽链借助氢键排列成特有的局部结构 包括 螺旋 折叠 转角等 螺旋是蛋白质中最常见 最典型 含量最丰富的二级结构元件 可以稳定存在 螺旋是一种重复性 结构 螺旋中每个 碳的 和 分别在 57 8 度和 47 度左右 位于允许的拉氏构象图最小能量区的中央 每 圈螺旋占 3 6 个氨基酸残基 两个螺旋之间的螺距为 0 54nm 每个残基绕轴旋转 100 度 沿轴上升 0 15nm 螺旋的直径约为 0 5nm 残基的侧链伸向外侧且交错排列 使空间位阻达到最小 从 N 末端出发 每个肽基 的 C O 与其前面第三个肽基的 N H 之间形成氢键 氢键的取向与螺旋轴基本平行 由氢键封闭的环是 13 元环 因此 螺旋也称之为 3 6 13 螺旋 2 超二级结构 在蛋白质分子中特别是球状蛋白质分子中经常可以看到由若干相邻的二级结构元件 主 要是 螺旋和 折叠片 组合在一起 彼此相互作用 形成种类不多的 有规则的二级结构组合或二级结构 串 在多种蛋白质中充当三级结构的元件 被称之为超二级结构 这是一种 螺旋束 它经常是由两股平行或者反平行的右手螺旋段互相缠绕而成的左手卷曲螺旋 是纤维状蛋白和原肌球蛋白的主要结构元件 氨基酸序列分析表明 这些多肽链中存在七残基重复序列 由 2 个疏水残基 2 个极性残基 3 个电荷残基组成 这是卷曲螺旋的结构特征 在卷曲螺旋中一股 螺旋 链的非极性边缘与另一股链的非极性边缘彼此啮合形成疏水核心 而电荷残基组成的极性边缘位于卷曲螺旋 的外侧 与溶剂相互作用 以此稳定卷曲螺旋 3 三级结构 由二级结构元件 螺旋 折叠片 无规卷曲等 构建成的总三维结构 也包括一级结构 中相距较远的肽段之间的几何相互关系和侧链在三维空间中彼此间的相互关系 由氨基酸的非极性侧链之间 的疏水作用或是一些蛋白中的二硫键使三级结构保持稳定 全 结构蛋白质 这类蛋白质是 螺旋占极大优势的蛋白质 又可以分为几个亚类 其中最简单也是最 大的亚类是反平行螺旋束 相邻螺旋之间以环相连 形成近似筒形的螺旋束 4 结构域 分子量大于 15000 的蛋白质三级结构通常被分成几个清晰的区域 被称之为结构域 结构域 就是一个多肽的紧密折叠区域 通常由 100 200 个残基组成 里面包含了许多超二级结构的组合 结构域有 时又被称为功能域 如乳糖脱氢酶 有一个二核苷结合区域 底物结合域 磷酸果糖激酶的不同功能由不同的域完成 其中 一个亚单位由两个域组成 一个是活性位点 另一个是异构效应物位点 可以结合活化剂和抑制剂 5 四级结构 具有完整三级结构的同一单体或者多种单体形成的聚合体 组成单体的亚基表面之间有范 德华力的作用 亚基之间可以接触 但不会相互贯穿 由两个或者两个以上亚基组成的蛋白质统称为寡聚蛋 白质或多聚蛋白质 寡聚蛋白质包括许多重要的酶和转运蛋白 仅由一个亚基组成 无四级结构的蛋白质如 核糖核酸酶被称为单体蛋白 由单一类型的亚基组成的多聚蛋白质 称为同多聚蛋白质 如肝乙醇脱氢酶 酵母己糖激酶等 由几种不同类型的亚基组成的 称为杂多聚蛋白质 如血红蛋白 天冬氨酸转甲酰酶等 3 何谓何谓 Long Interspersed Nuclear Elements 你认为该序列的进化起源是什么 你认为该序列的进化起源是什么 答 长散在重复序列 Long interspersed nuclear elements LINE 即散在分布的长细胞核因子 是散在分布 在哺乳动物基因中的一类重复序列 重复序列较长 且是可以自主转座的一类反转录转座子 来源于 RNA 聚合酶 的转录产物 另一类短散在重复序列的细胞核因子称为 short interspersed nuclear elements SINE 是非自主转座的反转录转座子 来源于 RNA 聚合酶 的转录物 L1 是 LINE 中的一种重复序列 长约 6500bp 哺乳动物基因组中的拷贝数可多达 10 万份 主要集中在 A T 富集区 L1 以及由 L1 编码的反转录酶作用于其他非自主反转录转座子以后所生成的 DNA 序列 加起来 至少占人类基因组全长的四分之一 LINE 不同成员之间的序列有较大差别 但是同一物种中的 LINE 的不同 成员仍有较大的同源性 LINE 有分别长 1137bp 和 3900bp 的可读框 这两种可读框有 14bp 的重叠序列 从 LINE 的结构分析 它并不具有反转录病毒特有的 LTR 因此曾把 LINE 归于非病毒超家族 测序的结果发现 LINE L1 的一个可 读框同反转录酶是同源的 这提示 LINE 可能来源于能够编码转座所需的酶进行自主转座的可动元件 所以 现在在分类时被归人病毒超家族 4 简述大肠杆菌 简述大肠杆菌 DNA聚合酶聚合酶 III 各亚基的功能 各亚基的功能 DNA 聚合酶 III 由 等 10 种不同的亚基组成 含有锌原子 和 三种亚基组成全酶 的核心酶 1 具有 5 3 方向合成 DNA 的催化活性 但无校对活性 2 具有 3 5 外切核酸酶的校对功能 3 使 核心酶相互连接 起组装作用 4 促使 DNA 核心酶二聚化 与模板连接 具有 ATP 酶活性 5 功能犹如 夹子 两个 亚基形成环状结构夹住 DNA 分子并可向前滑动 使聚合酶在完成复制前不再脱离 DNA 从而 提高酶的持续合成能力 6 是一种依赖 DNA 的 ATP 酶 两个 亚基和另外四个亚基 形成 亚基复合 物 2 其主要功能是帮助 亚基夹住 DNA 故称为夹子器装置 5 阐明端粒结构与端粒酶的功能 阐明端粒结构与端粒酶的功能 答 1 端粒 是真核细胞染色体末端的特殊结构 由端粒 DNA 和端粒 DNA 特异性结合蛋白组成的核蛋 白复合物 端粒结构 由连续的重复序列组成 大约 1000 个拷贝 不同种类的细胞的重复序列不同 在人中这个 重复序列是 TTAGGG 在模式生物纤毛虫中是 TTGGGG 在酵母中是 TG1 3 C1 3A 该重复序列通常一条 链上富含 G 另一条链上富含 C TG 链比 AC 链更长 形成 3 单链末端 2 端粒酶 端粒酶是一种 RNA 指导的 DNA 聚合酶 并且是一种逆转录酶 包括蛋白和 RNA 两部分 功能 端粒可以稳定染色体的末端结构 防止染色体间末端连接 RNA 分子上的序列可以和端粒上的 重复结构互补 因此可补偿滞后链 5 在消除 RNA 引物后造成的空缺 端粒酶 RNA 的功能是作为端粒串联重 复序列拷贝合成的模板 通过滑动机制来合成重复序列 当一个重复序列合成后 酶在端粒上发生移动 到 一个新位置后重新开始重复序列的合成 另一条链可能是通过后随链机制合成 酶的蛋白部分可以帮助端粒 酶的聚集 没有端粒酶 细胞只能进行非常有限的分裂 染色体的末端在没有合成之前就被降解 与之相反 的是 如果端粒酶出现在了不该出现的地方 可能会导致细胞的过度分裂 6 简述引起倾向性突变的修复系统 简述引起倾向性突变的修复系统 答 SOS 修复 又称易错修复 是指 DNA 受到严重损伤 细胞处于危机状态下时所诱导的一种 DNA 修 复方式 但是特异性低 对碱基的识别和选择能力差 修复结果只能是维持基因组的完整性 提高细胞的生 存率 但留下的错误较多 会引起倾向性突变 修复机理 在正常情况下 修复蛋白的合成处于低水平状态 这是由于他们的 mRNA 合成受到阻遏蛋白 LexA 的抑制 当 DNA 严重受损时 损伤部位不能被切除修复或重组修复 DNA 复制被中断 单链 DNA 缺 口数量增加 RecA 蛋白大量表达并与这些缺口处单链 DNA 结合 被激活成有活性的蛋白酶 将 LexA 蛋白 切割成没有阻遏和结合操纵区 DNA 活性的两个片段 因此 SOS 体系相关酶类高效表达 催化空缺部位 DNA 的合成 DNA 得到修复 只要有活化信号存在 该操纵子就一直处于活性状态 修复完成后 活化信号消失 Rec 蛋白又回到非蛋白水解酶的形式 LexA 蛋白才逐渐积累并重新建立阻遏作用 SOS 修复中用于配对的核 苷酸几乎是随机的 虽保证了 DNA 双链的完整性使细胞得以生存 但却给细胞带来很高的突变率 7 阐述原核生物阐述原核生物 DNA修复的修复的 BER NER DNA Mismatch repair system NHEJ SOS Repair TLR 机制 机制 答 1 BER 碱基切除 是指碱基烷化或者脱氨后 被特殊的 DNA 糖基化酶从 DNA 上移除的修复方 式 首先由 DNA 糖基化酶家族在碱基上滑动来识别特异性的核苷酸 DNA 糖基化酶可以把修饰核苷酸的碱 基切除 在 DNA 上形成脱嘌呤或者是脱嘧啶位点 这些位点可以被 AP 内切酶所识别 然后切除主链上的核 糖磷酸 最后 切除所形成的缺口被 DNA 聚合酶 I 和 DNA 链接酶修复 2 NER 核苷酸切除 是指移除一段在 DNA 双螺旋中已经变异的核苷酸链 再进行修复的方式 这项 修复途径需要 UvrABC 编码的内切酶 UvrD 编码的解旋酶以及 DNA 聚合酶 I UvrA 有 A TP 酶活性 是一 种可以和 DNA 结合的蛋白质 包含了锌指结构 以二聚体的形式发挥作用 识别并结合受损失的 DNA UvrA 的作用是引导 UvrB结合到损伤位点 UvrB 一种内切酶 有 A TP 酶活性 但只有在和 UvrA 结合的情况下 才有活性 UvrC 与 UvrB结合后形成复合体 这个复合体与受损伤 DNA 两侧都结合 即 UvrC 与受损部位 5 端的 7 个核苷酸相结合 同时与受损部位 3 的 4 个核苷酸相结合 UvrD UvrD 解旋酶与上述复合体相结合 并解开双链 这样可以把含有受损伤位点的单链移除 被移除的区域由 DNA 聚合酶 I 和 DNA 连接酶修复 3 DNA 错配修复 DNA Mismatch repair DNA 错配修复系统可以识别合成链中的新链 因为新合成 链没有甲基化 而亲本链被甲基化 这样的双链 DNA 分子被成为半甲基化 DNA 配修复系统能够从远处 对错配位点进行修复 修复需要 mutS mutL mutH 基因的产物 MutS 识别并且结合在碱基错配位点 MutH 结合在半甲基化的 GA TC 序列上 并切开非甲基化链 MutL 连接 MutS 和 MutL 组成一个复合体 位于 MutH切口和错配位点切口之间的 DNA序列被内切酶 I 或者 VII 移除 留下的缺口被 DNA聚合酶 III 和 DNA 连接酶修复 4 NHEJ 非同源性末端接合修复 通常修复双链的断裂 KU 异二聚体能够识别断裂双链 并与 DNA PK 结合 Mre11 复合体把 DNA 裂口末端连到一起 并进行加工 DNA 连接酶 IV 和 XRCC4 修复 DNA 末端 5 SOS 修复 细菌 DNA 在受到很大伤害或者 DNA 修复被抑制时才发挥作用 有超过 20 种基因参与了 修复 最重要的两种是 lexA 和 recA LexA 一种能够调节其他 SOS 修复基因表达的阻遏物 包括 recA 也能够调节自身的合成 RecA 蛋白 是一种多功能蛋白 有 A TP 酶活性和单链 DNA 结合活性 当它和单链 DNA 结合时 就成为一种辅蛋白水 解酶 细胞受到伤害或者严重逆境能产生单链 DNA 激活辅助蛋白水解酶活性 RecA 辅助蛋白水解酶活性 可以激活 LexA 蛋白的蛋白水解酶活性 所以 LexA 不能再阻遏转录 SOS 修复基因被诱导表达 被诱导表 达的修复基因包括 uvrABC uvrD UmuC UmuD UmuD 被 RecA 辅助水解蛋白切开 成为 UmuD 与 UmuC 组成 DNA 聚合酶 V DNA 聚合酶 V 需要 DNA 聚合酶 III 的亚基来得到最佳酶活性 DNA 合成由 DNA 聚 合酶 V 完成 但有修复出现错误的倾向 6 TLR 当细胞不能修复一些损伤时 可以用跨损伤 DNA 合成进行修复 跨损伤合成由特殊的 DNA 聚 合酶催化 能够直接跨过损伤位点进行 DNA 合成 跨损伤合成是 SOS 修复的一个部分 在缺少 DNA 聚合 酶 III 的情况下发生 复制被损伤的部位阻止 RecA 蛋白和模板链结合 形成 RecA DNA 片段 聚合酶 V 与复制的起始端结 合 亚基作为滑动装置在 DNA 链上滑动 损伤部位被通过后 再由 DNA 聚合酶 III 指导 DNA 的复制 8 阐述阐述 DNA 同源重组同源重组 HOLLIDAY模型模型中相关的重要蛋白质及其作用 中相关的重要蛋白质及其作用 答 主要蛋白 RecA RecBCD RuvA RuvB and RuvC 1 RecA 有 352 个氨基酸残基 分子量为 38kDa 是多功能的动力蛋白 具有链交换 A TP 酶活性和辅 助性蛋白酶活性 可以是 DNA 发生单链同化 即是一条单链与一条双链体中的同源部分发生置换 在大肠 杆菌的 DNA 重组中是必不可少的 RecA 蛋白协调地结合到单链 DNA 分子上 每一个 RecA 蛋白可跨过 4 6 个核苷酸 形成的复合体由 5 3 前进 这个复合体相当稳定 其活性可促进链交换 2 RecBCD 由 recB C D 三个基因分别编码的三个亚基构成 有五种酶活性 核酸外切酶 解旋酶 核酸内切酶 A TP 酶 单链 DNA 核酸外切酶活性 3 RuvA 是一个能够识别 Holliday 连接点的小蛋白质 它在交换点与所有 4 条链结合 形成两个四聚 体 将 DNA 夹住 并且协助 RuvB解旋酶促进分叉的移动 可以调节链交换 4 RuvB 是一个六聚体的解旋酶 只与双链结合不与单链结合 有 A TP 酶活性 为分叉迁移提供动力 它的六聚体环状结构结合在每条双链体 DNA 交换点的上游 5 RuvC 是一个核酸内切酶 能专一性地识别 Holliday 连接点 可以把四条链中的两条链切开而解开重 组中间体 9 阐阐述易位因子概念和述易位因子概念和易位易位机制 机制 答 1 易位因子的概念 是一种可以由染色体的一个位置转移到另外位置的遗传因子 也就是一段可以 发生转座的 DNA 又称为转座子 细菌的易位因子有两大类 一类是插入序列 IS 是简单的转座子 除转座所需的基因外不携带任何宿 主基因 末端具有倒置重复序列 是细菌染色体或质粒 DNA 的正常组成部分 常被定为到特定的基因中造 成基因突变 另一类是复合型转座子 是一类带有某些抗药性基因或其他宿主基因的转座子 两翼往往是两 个相同或高度同源的 IS 序列 且其转座能力由 IS 序列决定和调节 2 易位机制 1 复制型转座 Replicative transposon 转座子被复制 转座实体是原转座子的一个拷贝 即转座子中作为移动的部分被拷贝 由该拷贝插入到受体位点 供体位点序列不变 因此供体和受体位点都 有一个拷贝的转座子 2 非复制型转座 Nonreplicative transposon 转座因子做物理性运动 直接从一个位点 转移到另一个位点 这种转座过程中涉及到转座子从供体 DNA 的释放 需要一个转座酶 非复制型转座导 致转座子插入到靶位点以及从供体位点丢失 3 保守型转座 Conservitive transposon 另一种非复制型转座 在这种情况下 转座元件从供体位点上切除 然后插到靶位点上 在这一过程中 碱基是保守的 只是序列 的直接移动 没有核苷酸键的损失 原位点没有链断裂 运用这一机制的转座子较大 不仅可以转移转座子 本身而且还以将供体菌的 DNA 转移到另一个细菌 10 原核生物启动子所组成的保守序列和终止子特异序列是什么 如何分析大肠杆菌启动子保原核生物启动子所组成的保守序列和终止子特异序列是什么 如何分析大肠杆菌启动子保 守序列的重要性 守序列的重要性 答 1 启动子 启动子是指RNA聚合酶识别 结合和开始转录的一段DNA序列 在原核生物中 绝大 部分的启动子都存在位于 10bp处的TATAAT区和 35bp处的TTGACA区 这两个区是相当保守的序列 是RNA 聚合酶与启动子的结合位点 能与 因子相互识别而具有很高的亲和力 35区和 10区之间的距离为17 1bp 保持启动子这二段的序列以及它们之间的距离很重要 否则会改变它所控制的基因的表达水平 2 终止子 是指提供转录终止信号的DNA序列 所有原核生物的终止子在终止点之前均有一个回文结 构 其产生的RNA可形成茎环而构成发卡结构 大肠杆菌中有两类终止子 不依赖于rho因子的终止子 简单终止子 和依赖于rho因子的终止子 简单 终止子除能形成发卡结构外 在终点前还有一段由6 8个A组成的序列 所以转录产物的3端为寡聚U 其回文 对称区通常有一段富含G C的序列 依赖于rho因子的终止子必须在rho因子的存在下才能发生终止作用 回文区不富含G C 也无寡聚U 依 赖rho因子的转录终止区DNA序列缺乏共性 Rho因子是一个相对分子量为2 0 105的六聚体蛋白 是一种NTP 酶 通过催化NTP的水解促使新生RNA链从三元转录复合物中解离出来 从而终止转录 RNA合成起始以后 rho因子吸附在新生的RNA链上 靠ATP水解产生的能量 沿5 3 方向朝RNA聚合酶移动 到达RNA的3 OH 端后取代了暂停在终止位点上的RNA聚合酶 使之从模板DNA上释放mRNA 完成转录过程 3 大肠杆菌启动子保守序列的重要性 a 10bp 处的 TATAAT 区和 35bp 处的 TTGACA 区是 RNA 聚合酶与启动子的结合位点 能与 因子相 互识别而具有很高的亲和力 b 两个保守序列之间的距离是 16 19bp 小于 15bp 或者大于 20bp 都会降低启动子的活性 改变启动子 所控制基因的表达水平 c 如果突变使启动子与保守序列的吻合度降低 则启动子变弱 如果突变使启动子与保守序列吻合度上 升 则启动子变强 d 通过突变改变启动子的保守序列 可以形成不同的启动子 不同的启动子和不同的 RNA 聚合酶结合 达到调控转录的目的 11 RNA 聚合酶聚合酶 III 识别的启动子有哪几类 其定位因子是什么 识别的启动子有哪几类 其定位因子是什么 答 RNA聚合酶III位于核质内 负责合成tRNA和snRNA 5S rRNA和tRNA基因的启动子是内部启动子 位于起始位点下游 snRNA基因的启动子类似于其它启动子 位于起始位点上游 两种情况下 启动子的功 能元件都是由可被转录因子识别的序列组成 并且反过来影响RNA聚合酶III的结合 1 RNA聚合酶III有三种类型启动子的结构 包括两种类型的内部启动子 类型I和类型II 每个都含有两个分开的结构 其中两个短序列元件被一 个多变的序列分开 类型I由boxA序列和一个隔开的boxC序列组成 类型II由boxA序列和一个隔开的boxB序 列组成 且A盒和B盒之间的距离可以变化很大 但若太近则会失去其功能 类型III启动子 其被分隔的启动子序列在起始位点上游 有三个上游元件Oct PSE TA TA RNA聚合酶III 在上游启动子的起始可紧靠起始位点上游的邻近序列TA TA就可以发生 但若是具有Oct PSE 这些元件的结 合因子能够起相互协调作用 大大提高转录效率 2 定位因子 RNA聚合酶III启动子的辅助因子在RNA聚合酶之前先于启动子结合 形成起始复合体指 导RNA聚合酶结合 RNA聚合酶III通过内部启动子起始转录过程中 包含着TFIIIA TFIIIB TFIIIC以及聚合酶的依次组装 TFIIIA和TFIIIC是装配因子 其作用是帮助TFIIIB结合在正确的位置 TFIIIB是RNA聚合酶III所需要的真正 起始因子 负责RNA聚合酶III的正确定位 上游的第III类启动子 TA TA元件被一个包含TBP的因子识别 多种转录因子直接识别上游位点形成前起 始复合体 此复合体再被RNA聚合酶III所识别 12 列出你所知的列出你所知的 RNA聚合酶聚合酶 II 识别的启动子顺式作用因子 识别的启动子顺式作用因子 答 RNA聚合酶II启动子涉及众多编码蛋白质基因表达的控制 该类型启动子包含四类控制元件 基本 启动子 起始子 上游元件和应答元件 这些元件的不同组合 再加上其他序列的变化 构成了数量十分庞 大的各种启动子 他们受相应转录因子的识别和作用 1 TATAbox 通常位于起始位点上游约25bp处 它组成唯一的上游启动子元件 此元件距起始位点有相 对固定的位置 可以在所有真核生物中找到 TATA盒倾向于被富含G C对的序列环绕 可能是TATA盒起作 用的一个因素 具有选择定位转录点的功能 作为定位因子起作用 2 GCbox 通常在起始位点上游40 70bp处 是转录因子SP1的核心结合位点 在两个方向上都可以加强 转录 3 CAATbox 约在 75bp处 决定了转录起始的效率 4 核苷酸八聚体Oct 能增强真核生物启动子的转录功能 5 initiator 启动子中最常见的元件 有TFIID识别位点 可以和TFIID结合 TFII I和YY1因子也可以和 initiator结合 6 DEP 上游核心启动子元件 上游TFIID识别序列 对转录活性很重要 7 MET 类似于DEP MET也可以和Inr协同作用 但要求有严格的Inr MET区域 当TATA box和DEP 突变导致转录活性降低时 MET 起到了补充作用 总之 通过各种元件组合的调控因子直接作用于转录因子的靶位点 促进转录起始复合物的组装 但是 这些元件必须在一定距离范围内才能共同发挥最大转录活性 13 从 从 COMBINATORIAL CONTROL 的观点来讨论多蛋白作用于真核生物转录的作用 的观点来讨论多蛋白作用于真核生物转录的作用 14 请阐述请阐述 RNA EDITING 和和 RNA HOMING 概念 概念 答 1 RNA 编辑 是指在 mRNA 水平上改变遗传信息的过程 具体说来 指基因转录产生的 mRNA 分 子中 由于核苷酸的缺失 插入或置换 基因转录的序列不与基因编码序列互补 使翻译生成的蛋白质的氨 基酸组成 不同于基因序列中的编码信息的现象 RNA 编辑同基因的选择性剪接或可变剪接一样 改变 DNA 模板来源的遗传信息 翻译出多种氨基酸序 列不同的蛋白质 RNA 编辑的结果不仅扩大了遗传信息 而且使生物更好地适应生存环境 有些基因的主要 转录产物必须经过编辑才能有效起始翻译 或产生正确的可读框 这可能是生物在长期进化过程中形成的 更经济有效地扩展原有遗传信息的机制 2 RNA 归巢 在 I 类和 II 类的某些内含子中含有开放阅读框 可产生具有三种功能的蛋白 这些蛋白可 使内含子移动而插入到一个新的靶位点 这个现象即为 RNA 归巢 I 类内含子的归巢由 DNA 介导的机制进 行调节 II 类内含子的归巢由 RNA 介导的机制调节 15 请阐述请阐述 RNA 剪切中具有催化功能的剪切中具有催化功能的 RNA分子 核酶 的作用及应用的研究进展 分子 核酶 的作用及应用的研究进展 答 1 概念 核酶是一类具有催化功能的RNA分子 通过碱基配对与相应的RNA底物结合 并在特定 的位点剪切底物分子 从而阻断基因的表达 核酶的种类很多 从结构上看主要有发卡状核酶和锤头状核酶 2 功能 不同的核酶有不同的催化功能 可以分为剪切型核酶和剪接型核酶两大类 剪切型核酶只剪不 接 能够催化自身RNA或者不同的RNA分子 切下特异性的核苷酸序列 剪接型核酶有序列的内切核酸酶 RNA连接酶等多种酶活性 它既能切割RNA分子 也能通过转酯反应形成新的磷酸二酯键 连接切割以后的 RNA分子 3 应用 从目前来看 核酶的应用主要在基因治疗上 即将核酶基因导入细胞内 使其在细胞内表达出 相应的核酶 从而对mRNA进行切割 在翻译水平阻止某些基因的异常表达 达到治疗疾病的目的 应用的研究进展 1 应用于生命起源的研究 2 植物病毒防治的研究 通过烟草花叶病毒基因组的基本 结构 设计了针对于TMV不同识别位点的核酶 3 人类疾病防治的研究 组合筛选法 在人类肝癌细胞中筛 选了可以抑制乙肝病毒复制的发夹型核酶 核酶用于肿瘤治疗的主要机制是裂解癌基因 一种能剪切Rer1 mRNA的核酶 能将紫外线诱导的细胞突变率降低25 4 靶基因的识别 5 生物传感器分子 核酶的应用举例 核酶在肿瘤治疗中的应用主要集中在以下几个方面 1 核酶与癌基因 核酶独特的切 割目的基因的方式有可能阻断癌基因的表达 从而逆转肿瘤细胞恶性增殖 并诱导其分化和凋亡 2 核酶和 多药耐药性 多药耐药性MDR是肿瘤化疗失败的主要原因 设计核酶抑制耐药相关基因的表达 使耐药的肿 瘤细胞重新获得对化疗药物的敏感性 核酶在抗病毒中的应用 1 抗艾滋病病毒HIV 利用特异性核酶在细 胞内抑制HIV 1的LTR mRNA表达 能明显降低HIV 1病毒蛋白的表达水平 从而达到抑制病毒复制的作用 2 抗乙肝病毒HBV 核酶能特异性地切割HBV前基因组RNA 使其丧失模板 尽管核酶已经开始应用于人体治疗 但尚有许多问题待解决 例如 如何获得高效无毒的特异性核酶 如何选择靶序列中的最佳切割位点 如何提高核酶进入靶细胞的效率并稳定发挥作用等 16 Alternative Splicing 的类型 功能和机制举例 的类型 功能和机制举例 答 1 选择性拼接的类型 1 拼接产物缺失一个或几个外显子 2 拼接产物保留一个或几个内含子作为 外显子的编码序列 3 外显子中存在 5 或 3 拼接点 从而部分缺失该外显子 4 内含子中存在 5 或 3 拼接点 从而使部分内含子变为编码序列 2 功能 1通过选择性拼接 基因转录可以得到许多不同的产物 这些产物的结构和功能具有多样性 例 如 一个基因通过不同的方式拼接 可以得到不同的 mRNA 翻译产物 原肌球蛋白基因可以得到 10 个不 同蛋白质产物 钙蛋白可以产生 64 个蛋白质同源体 2通过选择性拼接可以调节控制基因的表达 例如 果 蝇的性分化是由一系列基因产物相互作用的结果 通过关键基因转录物地选择性拼接决定了果蝇的性别 3 机制 1第一种类型 初级转录RNA上存在剪接位点和抑制位 且两个位点靠的非常近 可以看做是 同一个位点 如果是剪接物与该位点结合 则剪接可以发生 如果是抑制物与该位点结合 则剪接不发生 2第二种类型 初级转录RNA上有剪接位点和剪接增强子 剪接物如果只和剪接位点结合 则剪接不发 生 如果剪接物和剪接位点结合后 又有激活剂与增强子结合 则剪接发生 17 tRNA氨酰合成酶以怎样的方式保证正确的氨酰合成酶以怎样的方式保证正确的tRNA RR的合成 的合成 答 氨酰tRNA合成酶正确识别相应tRNA并使其氨酰化 可维护翻译的精确性 是中心法则的重要保障 1 每一个氨酰 tRNA合成酶都可以识别一个特定的氨基酸和与此氨基酸对应的tRNA的特定部位 最后形成氨 酰 tRNA 2 氨酰 tRNA合成酶有校对功能 可检验合成的氨酰 tRNA 许多氨酰 tRNA合成酶有第二个活性部位 称 为校正部位 用于水解非正确组合的氨基酸和tRNA之间的共价联系 经过校正部位的作用 可使翻译过程的 错误频率小于万分之一 3 特殊的起始tRNA识别翻译的起始点 所有蛋白质的翻译都起始于甲硫氨酸的参与 特殊的tRNA rRNAi Met 复责对起始氨基酸甲硫氨酸的掺入 它对选择在mRNA上什么位置开始翻译非常重要 4 tRNA上的反密码子与mRNA上的密码子配对 确保合成氨基酸顺序的正确性 18 讨论实现真核生物讨论实现真核生物 蛋白基因在大肠杆菌细胞中受控 稳定 分泌和高效表达的分子元件 蛋白基因在大肠杆菌细胞中受控 稳定 分泌和高效表达的分子元件 答 要实现真核生物蛋白基因在大肠杆菌细胞中受控 稳定 分泌和高效表达 首先要构建有效的原核 表达载体 包括一个强大并且可以严紧调节的启动子 位于翻译起始密码子 5 端大约 9bp 的 SD 序列 位于 目的基因 3 末端的一个高效转录终止子 其他的元件包括转录和翻译增强子等 载体还需要一个具有复制起 点 筛选标记和利于对启动子活性进行严紧调节的基因 一般可以在目的基因的上游加上乳糖操纵子 培养 的时候先扩增生物量 再诱导可调控型表达生成产物 另外 减少 E coli 中异源蛋白质的降解 使用融合蛋 白表达方法高效表达和纯化重组蛋白 利用分子伴侣共表达 促进蛋白质翻译后正确折叠 寻找合适的培养 基和培养方法等都有助于实现真核蛋白基因的高效表达 1 启动子 在 E coli 中发挥作用的启动子必须具有适合高水平蛋白质合成的某些特性 启动子的作用要 强 必须表现最低水平的基础转录活性 2 转录终止子 虽然转录终止子在表达质粒的构建过程中常被忽略 但有效的转录终止子是表达载体必 不可少的元件 具有极其重要的作用 贯穿启动子的转录 抑制启动子的功能 造成所谓的启动子封堵 3 转录抗终止子 来源于 E coli rRNA 操纵子的转录抗终止区已被用于某些表达载体如 pSE420 该载体 应用 trc 启动子 其基本原理是使得转录通过重度二级结构区 从而减少宿主 RNA 多聚酶引起的转录提前终 止的可能性 4 严紧型调节表达系统 具有可严紧调节启动子的优点 使得我们能够设计许多巧妙 可高度抑制的表 达系统 在表达那些产物对宿主的生长不利的基因时尤其有用 5 mRNA 翻译起始区 SD 序列 mRNA 转录本 5 末端的独特结构是 mRNA 翻译起始效率的最主要决定 因素 SD 位点在翻译起始阶段与 16S rRNA 的 3 端相互作用 SD 与起始密码子间的距离约为 5 13bp 这一 距离影响翻译起始的效率 除了 SD 区与 16SrRNA 结合之外 mRNA 和核糖体的其他相互作用也参与翻译的 起始 如核糖体 S1 蛋白直接参与 30S 亚基对 mRNA 的识别和结合 6 翻译增强子 已经在细菌和噬菌体中鉴定了一些在 E coli 中显著增强异源基因表达的序列 7 保护 mRNA 的稳定性的元件 mRNA 的快速降解势必影响蛋白质的产生 在 E coli 中有两类保护性元 件能够稳定 mRNA 一类由 mRNA 的 5 UTRs 中的序列组成 另一类由 3 UTRs 和多顺反子间区的发卡结构 组成 其中一些元件与异源 mRNA 融合后起稳定剂作用 但只在严格的条件下如此 8 翻译终止元件 mRNA 中的终止信号是翻译终止过程必不可少的 除了三个终止密码子 UAA UGA 和 UAG 外 翻译终止这一复杂事件还包括核糖体 mRNA 和终止位点的几种释放因子的特异相互作用 在 设计表达载体时 通常插入三个终止密码子以防止核糖体的跳跃 在 E coli 中偏向于使用 UAA 密码子 9 密码子的使用 富含 E coli 不常用密码子的外源基因有可能在 E coli 中得不到有效表达 且通过用常 用密码子替换稀有密码子或与 稀有 tRNA 基因共表达可以提高外源基因在 E coli 中的表达 10 蛋白质的蛋白酶解 蛋白酶解是一个选择性的 高度调节的过程 该过程参与许多代谢活动 E coli 在细胞质 细胞外周质 内膜和外膜有许多蛋白酶 这些蛋白酶参与宿主的代谢活动 如选择性地清除异常 和错误折叠的蛋白 11 融合蛋白表达 在 E coli 中表达外源蛋白 尤其是真核蛋白时 蛋白质的稳定性是经常遇到的问题 最近几年 众多巧妙的蛋白质 融合系统的发展 为 E coli 中高效表达和纯化重组蛋白提供了极大方便 融合表达具有多方面的优点 如防止包涵体的形成 促进蛋白质的正确折叠 限制蛋白酶解和利于纯化 13 分子伴侣 目前已经达成共识 有效的蛋白质翻译后折叠 多肽装配成寡聚体结构以及蛋白质的转位 都是由一种被称为分子伴侣的专职蛋白来介导的 但是 只过度表达单一的伴侣分子可能不太有效 在某些 情况下 共表达与靶蛋白来源相同的伴侣分子可能是必要的 19 解释小分子效应物在原核生物中基因表达调控的作用和机制 解释小分子效应物在原核生物中基因表达调控的作用和机制 并举例并举例 答 1 通过 亚基替换的调控 原核生物转录起始时 RNA 聚合酶依赖 因子来识别和结合被转录基 因 当一种新的 因子被激活后 原来的 因子就被取代 通过 因子转移的方式来打开或关闭基因的表达 而 因子的量则能有效地影响基因表达的水平 2 小分子干扰 RNA 小分子干扰 RNA 与目标分子互补形成双链区 通过改变靶分子的二级结构来控制 靶分子的活性 其靶分子为单链核酸序列 典型的有反义 RNA 与 mRNA 互补 是一种小分子干扰 RNA 作用机制 与 mRNA 上核糖体结合位点结合 使得翻译不能起始 与 mRNA 形成双螺旋结构 作 为内切酶底物 与转录产物结合 使转录提前终止 3 阿拉伯糖操纵子 阿拉伯糖的降解需要三个基因 araB araA araD 形成一个基因簇 araBAD 与 araBAD 相邻的是一个复合的启动子区域 两个操纵区 O1 O2 和一个调节基因 araC AraC 蛋白同时显示正 负调节因子的功能 调控机制 1 当细胞内没有 araC 蛋白时 由 PC启动子起始 araC 基因转录 2 当体系中葡萄糖的水平较 高 阿拉伯糖水平较低时 AraC 蛋白与操纵区 O2以及 araI 诱导因子结合区上半区相结合 形成 DNA 回转 结构 araBAD 基因不表达 3 当体系中有阿拉伯糖但无葡萄糖存在时 AraC 蛋白与阿拉伯糖相结合 改变 构象成为激活蛋白 AraC 蛋白同源二聚体分别与 ar