大肠菌群三步法与两步法的比较.ppt

大肠菌群经典三步法和LST两步法的比较与评价 第一组 PPT制作 成都中医药大学PPT演讲 试验菌种 培养基培养 稀释 混匀待用 设置空白对照与多个平行 样品制备 检验过程 样品 三步法 两步法 乳糖发酵 平板分离 证实试验 初发酵 复发酵 查MPN检索样品中的总大肠菌群MPN值 统计学方法计算 试验样品 按照不同模拟污染水平进行人工添加 需氧及兼性厌氧 在37 能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌 一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌 柠檬酸杆菌 产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等 它不代表某一个或某一属细菌 而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌 以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染 大肠菌群数的高低 表明了粪便污染的程度 也反映了对人体健康危害性的大小 广泛应用于食品卫生工作 样品制备 1 试验样品种类与数量选择为了模拟大肠菌群在不同样品中生长环境不同 样品组成不同 选用种类不同的样品 如水 食物 化妆品等 食物样品又可分为肉类 乳制品 水产品 淀粉类 蔬果类等 同时避免选择添加了防腐剂的样品 选择合适的种类数与数量 处理前经检验确定无大肠菌群与干扰菌或进行高压蒸汽灭菌 2 空白试验在分析工作中 存在着系统误差 包括试剂及用水含有杂质所造成的误差等 为消除这部分影响 提高分析准确度 所以要做空白试验 样品制备 3 菌株选择将大肠菌群标准菌株 包括大肠埃希氏菌 肺炎克雷伯氏菌 阴沟肠杆菌 弗氏柠檬酸杆菌 于培养基中35 培养24h后混合 4 菌落计数用灭菌的磷酸盐缓冲液 磷酸盐缓冲液比生理盐水 NS 合适 因为PBS在稀释的同时可以保护菌体 调节pH值 而且市面上有成品出售 而NS只是纯粹的稀释液 进行十倍系列稀释至10 10 用后4个稀释度 用营养琼脂计数 每种浓度吸取1mL加到融化温度46 的15mL左右营养琼脂培养基中混匀凝固 35摄氏度培养24h 取出进行菌落计数 赵贵明 边凌淳 应用不同方法检测食品中大肠菌群结果的比较 微生物学杂志 2003年11月第23卷第6期 样品制备 菌落计数流程图 1 选择平均菌落数在30 300之间者进行计算 若只有一个稀释度平均菌落数符合此范围 则将该菌落数乘以稀释倍数报告 2 若有二个稀释度均在30 300之间时 按国家标准方法要求应以二者比值决定 比值小于或等于2取平均数 比值大于2则取较小数字 3 若所有稀释度均不在计数区间 如均大于300 则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告之 如均小于30 则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告之 如菌落数均不在30 300之间 则应以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之 如所有稀释度均无菌落生长 则报告未检出 检样 样品制备 5 试验样品制备按照不同样品类别分别按规定加入磷酸缓冲液处理 每份样品分高 中 低三个水平进行菌悬液人工添加 高度污染为添加600 1200CFU g 中度污染添加120 600CFU g 低度污染添加30 120CFU g 以保证样品含菌数量在检测范围内 同时用相同样品做三份平行试验与一份空白试验 均质后 18 保存备用 试验前用无菌磷酸缓冲液稀释至10 3 检验方法 三步法与两步法 三步法 水样接种到双料乳糖蛋白胨培养液中培养 产酸产气的发酵管转种在伊红美蓝琼脂平板上培养 挑选可疑菌落染色 镜检 证实试验 乳糖发酵试验 分离培养 证实试验 两步法 接种月桂基硫酸盐胰蛋白胨 LST 肉汤培养 从产气的LST肉汤管中取培养物移种于煌绿乳糖胆盐肉汤 BGLB 管中培养 初发酵试验 复发酵试验 三步法所用培养基及其作用 乳糖蛋白胨培养液蛋白胨 提供碳源和氮源满足细菌生长的需求牛肉膏 提供碳源乳糖 大肠菌群可分解的糖类氯化钠 可维持均衡的渗透压溴甲酚紫乙醇溶液 产酸指示剂蒸馏水 溶剂伊红美蓝培养基蛋白胨 提供碳源和氮源满足细菌生长的需求乳糖 大肠菌群可分解的糖类磷酸氢二钾 中和过量酸琼脂 培养基固化剂蒸馏水 溶剂伊红水溶液 大肠菌群特异性指示剂美蓝水溶液 大肠菌群特异性指示剂 两步法所用培养基及其作用 月桂基硫酸盐胰蛋白胨 LST 肉汤胰蛋白胨或胰酪胨 提供碳源和氮源满足细菌生长的需求氯化钠 可维持均衡的渗透压乳糖 大肠菌群可发酵的糖类磷酸氢二钾 K2HPO4 缓冲剂磷酸二氢钾 KH2PO4 缓冲剂月桂基硫酸钠 抑制非大肠菌群细菌的生长蒸馏水 溶剂煌绿乳糖胆盐 BGLB 肉汤蛋白胨 提供碳源和氮源满足细菌生长的需求乳糖 大肠菌群可发酵的糖类牛胆粉 oxgall或oxbile 溶液 抑制非肠杆菌科细菌0 1 煌绿水溶液 抑制非肠杆菌科细菌蒸馏水 溶剂 两步法所用培养基可否添加指示剂 对于LST而言 大肠菌群分解乳糖产酸产气 如果用指示剂一般就是用酸碱指示剂 LST培养基里有月桂基硫酸钠 SDS十二烷基硫酸钠 它是阴离子表面活性剂 水溶液呈碱性 为了让大肠菌群生长 培养基里就需要用磷酸缓冲液维持PH中性 所以加了酸碱指示剂也没有什么用 对于BGLB而言 BGLB中的煌绿本身就是指示剂 在培养基中呈绿色 它的指示范围是0 0 黄 2 6 绿 一般培养过程中都是绿色 不具有典型性和代表性 但是也有少数情况培养出来酸产生的过多变成了黄色 所以加了指示剂可能会干扰现象观察 加之大肠菌群分解乳糖产酸产气 有气泡就能判断 不用加指示剂 月桂基硫酸盐胰蛋白胨 LST 煌绿乳糖胆盐 BGLB 肉汤这两种培养基相对于乳糖胆盐蛋白胨水有什么特别之处 LST BGLB 乳糖蛋白胨培养基的区别 1 氮源区别BGLB与乳糖蛋白胨培养基氮源为蛋白胨 LST培养基氮源为胰蛋白胨 蛋白胨是将肉 酪素或明胶用酸或蛋白酶水解后干燥而成的外观呈淡黄色的粉剂 胰蛋白胨 又称胰酪蛋白胨 胰酶消化酪蛋白胨 是一种优质蛋白胨 是以新鲜牛肉和牛骨经胰酶消化 浓缩干燥而成的浅黄色粉末 主要区别在于 胰蛋白胨处理后 很多大分子的蛋白分子量变小 这样的话 细菌更容易利用 价格较蛋白胨贵 LST BGLB 乳糖蛋白胨培养基的区别 2 培养基中的抑制剂区别LST培养基中为月桂基硫酸钠 SDS 为阴离子表面活性剂 有表面活性作用 有利于提高革兰阴性菌活性与分散菌体的作用 就有更好的分离效果 所以作为鉴别的培养基 BGLB中煌绿是一种抑菌剂 主要抑制革兰氏阳性菌和部分革兰氏阴性菌 由于本培养基的抑菌作用非常强 所以可以排除一些假阳性的结果 常用作确证试验 乳糖蛋白胨培养基中没有加入抑制剂 所以需要用伊红美蓝培养基做特异性鉴别 三步法流程图 检样 稀释 乳糖蛋白胨培养基 36 1 24h 2h 不产气 大肠菌群阴性 产气 伊红美兰琼脂平板 报告 36 1 18h 24h 革兰氏染色 乳糖蛋白胨培养基 革兰氏阳性 革兰氏阴性无芽孢杆菌 大肠菌群阴性 报告 大肠菌群阳性 产酸产气 不产酸产气 报告 36 1 24h 2h 大肠菌群阴性 报告 乳糖蛋白胨培养基中大肠菌群生长现象 大肠菌群分解乳糖蛋白胨培养基产酸产气 溴甲酚紫是pH指示剂 酸性呈黄色 碱性呈紫色 大肠菌群发酵后呈黄色 空白对照呈紫色 大肠菌群发酵后产气 倒管内有气泡 空白对照则无气泡 伊红美蓝培养基上大肠菌群菌落现象 当大肠杆菌分解乳糖产酸时细菌带正电荷被染成红色 再与美蓝结合形成紫黑色菌落 并带有绿色金属光泽 检样 25g 或25ml 样品 225ml稀释液 均质 10倍系列稀释 选择适宜三个连续稀释度的样品匀液 接种LST肉汤管 36 1 48h 2h 不产气 产气 BGLB肉汤 36 1 大肠菌群阴性 大肠杆菌阳性 不产气 产气 查MPN表 报告结果 两步法流程图 48h 2h 大肠菌群在LST培养基中现象 大肠菌群在LST培养基中产气 倒管内有气泡 大肠菌群在BGLB培养基中生长现象 大肠菌群分解乳糖产酸产气 阳性结果倒管内均有气泡 若产酸过多 由于有指示剂煌绿存在 指示范围pH0 0黄 2 6绿 则由绿色变为黄色 右 结果计数 前提 若空白对照无大肠菌群检出 证明实验无系统误差干扰 结果准确性可以保证 计算三步法与两步法最终确证的大肠菌群阳性管数 检索国标中的MPN表 统计好每个样品MPN数 根据样品制备时加入的不同梯度 高 中 低 菌落形成单位与查询MPN表 看实际添加菌落形成单位是否落在MPN表的95 置信区间内 统计好两个方法落在范围外以及阴性管数与阳性管数 MPN表 MPN MostProbableNumber 最大可能数 统计学方法评价 将统计结果整理为四格表对检验结果进行卡方检验 属性 合计 组别 三步法 两步法 落在95 置信区间内阳性样品数 落在95 置信区间外阳性样品及阴性样品数 a T11 c T21 b T12 d T22 n1 a b n2 c d 合计 m1 a c m2 b d n a b c d 统计学方法评价 建立假设 H0 1 2 两种方法检出率相同H1 1 2 两种方法检出率不相同 0 05计算各个格子理论频数TijT11 n1m2 nT12 n1m2 nT21 n2m1