性传播疾病及实验室诊断.ppt

性传播疾病及其实验室诊断 梅毒 梅毒螺旋体银染色 梅毒螺旋体感染后人体的免疫 体液免疫 特异性抗体 二期梅毒病人血清中产生特异性抗梅毒螺旋体抗体 主要是IgM和IgG 早期为IgM和IgG 晚期为IgG 可终生存在 梅毒螺旋体制动抗体也是一种特异性抗体 IgM 可终生存在 它在厌氧有补体存在时 此抗体能抑制活的梅毒螺旋体运动 并能杀死梅毒螺旋体 抗心磷脂抗体 针对心磷脂的VDRL抗体主要是IgM 也有少量IgG 引起心磷脂抗体反应的抗原可能是感染组织损伤使细胞的线粒体膜释放出来 抗梅毒螺旋体粘多糖抗体 可以抑制梅毒螺旋体繁殖 促使病灶愈合的重要因素 血清中和因子 实验性梅毒免疫血清中含有一种能灭活梅毒螺旋体毒性的血清中和因子 梅毒螺旋体多肽抗体 有16种抗梅毒螺旋体多肽的抗体 而当疾病进入隐伏晚期或晚期时 又特异地丢失其中4 5种抗体 这种特异性抗体丢失 可能是造成疾病发展到晚期的条件 免疫复合物及IgE和梅毒螺旋体结合 研究证明 梅毒病人血清中有免疫复合物 其中含螺旋体抗原 梅毒病理中有循环免疫复合物的参与 梅毒治疗中的吉海反应 先天性梅毒和二期梅毒中肾损害均和免疫复合物有关 一期梅毒 一期梅毒 一期梅毒 主要症状为硬下疳硬下疳发生后1 2周梅毒血清试验变为阳性7 8周时全部病例均为阳性血清试验阴性并不能排除一期梅毒 特别是病期不足两周者 二期梅毒 二期梅毒的皮肤粘膜损害二期梅毒骨关节损害二期梅毒眼损害二期神经梅毒二期复发梅毒 二期梅毒玫瑰疹 二期梅毒玫瑰疹 二期梅毒玫瑰疹 二期梅毒玫瑰疹 二期梅毒疹 二期梅毒疹 二期梅毒肛周扁平湿疣 二期梅毒扁平湿疣 二期梅毒疹黏膜白斑 二期梅毒疹黏膜白斑 晚期梅毒 tertiarysyphilis 三期梅毒皮肤损害三期梅毒粘膜损害晚期骨梅毒晚期眼梅毒晚期心血管梅毒晚期神经梅毒晚期内脏梅毒 三期梅毒树胶肿 三期梅毒软腭陈旧性树胶肿形成上腭穿孔 胎传梅毒 早期胎传梅毒2岁以内发病者为早期胎传梅毒皮损与后天二期梅毒大致相似口周有放射状瘢痕为其特征肛周及外生殖器部位亦可发生扁平湿疣骨骼系统82 被损害可出现内脏损害皮肤粘膜梅毒晚期胎传梅毒眼梅毒骨梅毒神经梅毒先天潜伏梅毒 梅毒的实验室检查 一 梅毒螺旋体检查 暗视野显微镜检查 穿刺液 见有活动的梅毒螺旋体 在皮损处 用玻片刮取组织渗出液或淋巴结免疫荧光染色 在荧光显微镜下可见绿色的梅毒螺旋体 活体组织检查梅毒螺旋体 如用银染色法 Warthin starry 法或 Levoaditis法 或荧光抗体染色 可查见梅毒螺旋体 呈黑褐色 有螺旋结构 位于真皮毛细血管周围 银染色的阳性结果需谨慎解释 因为类似梅毒螺旋体的其他物质易混淆 而特异性荧光检查则更为可靠 梅毒血清试验 一 非梅毒螺旋体抗原血清试验 用心磷脂作抗原 测定血清中抗心磷脂抗体 亦称反应素 性病研究实验室试验 VenerealDiseaseResearchLaboratorytest VDRL 用心磷脂 卵磷脂及胆固醇为抗原 可作定量及定性试验 不加热血清反应素玻片试验 UnheatedSerumReaginUSR 是VDRL抗原的改良 敏感性及特异性与VDRL相似 快速血浆反应素试验 RapidPlasmareagintest RPR 是VDRL抗原的改良 敏感性及特异性与VDRL相似 优点是肉眼即可读出结果 RPR 二 梅毒螺旋体抗原血清试验 用活的或死的梅毒螺旋体或其成分来作抗原测定抗螺旋体抗体 荧光梅毒螺旋抗体吸收试验 FTA ABSTest 此法是较敏感和较特异的螺旋体试验 梅毒螺旋体血凝试验 TPHA 敏感性和特异性均高 操作简便 但对一期梅毒不如FTA ABS试验敏感 梅毒螺旋体制动试验 TreponemaPallidumimmobilization TPI 用Nichol株螺旋体 活的 加病人血清 含抗体 后 在补体的参与下可抑制螺旋体的活动 如 50 梅毒螺旋体停止活动 则为阳性 此试验特异性 敏感性均高 但设备要求高 操作难 仅供研究用 TPHA 三 基因诊断技术检测梅毒螺旋体 一 PCR引物的设计部位与序列 目前有四套扩增梅毒螺旋体DNA的系统 扩增47KDa膜抗原基因 tpp47基因 扩增39KDa碱性膜蛋白基因 bmp基因 扩增TpF1蛋白基因 tpf 1 或TyF1蛋白基因 tyf 1 和扩增tmpA基因 47 1CACAATGCTCACTGAGGATAGT648 66947 2ACGCACAGAACCGAATTCCTTG1284 1035Tpp47 3TTGTGGTAGACACGGTGGGTAC713 73447 4TGATCGCTGACAAGCTTAGGCT1187 1208TP3CAGGTAACGGATGCTGAGT256 275TP4CGTGGCAGTAACCGCAGTCT762 741bmpTP5 探针 GACCTGAGGACTCTCAAATC500 519TP7CTCAGCACTGCTGAGCGTAG172 191TP8AACGCCTCCATCGTCACACC788 769TF1CTCTTCAAGGAGCTCAT222 206Tpf 1F2AGACAGTGGTTATGCTC77 61或tyf 1F3 探针 ATTGCGCCAGCATGTAG114 130F4 探针 ATTGCGCCGGCATGTAG114 130 二 操作方法1 采集标本 根据病人的情况可采取局部分泌物 抽取淋巴结液 羊水 血清 脑脊液 用适量的蒸馏水稀释 保存于4 冰箱 2 标本处理 目的是为了暴露梅毒螺旋体的DNA 消除标本对PCR的抑制物 采用下列处理方法 煮沸法 低速离心法 碱裂解法 三 PCR扩增 四 PCR产物分析 取10 1反应产物用2 琼脂糖凝胶电泳 Southern印迹后 用寡核苷酸探针TP5 以32P作末端标记 杂交 双股DNA探针杂交 使用大片段双股DNA探针检测PCR产物 而不用合成的寡核苷酸探针 因为这样可通过标记得到较高 特异的放射活性 四 脑脊液检查 用于诊断神经性梅毒 包括细胞计数 蛋白量 VDRL试验 PCR检测 胶体金试验等 为除外无症状神经梅毒 二期梅毒有35 的病人脑脊液异常 所有梅毒病人凡病期超过一年者均应作脑脊液检查 所有早期胎传梅毒婴儿也应检查脑脊液以除外中枢神经系统受累的可能 脑脊液细胞计数和总蛋白量的增加属非特异性变化 脑脊液VDRL试验才是神经梅毒的较可靠诊断依据 但是 当有活动的神经梅毒存在时 脑脊液白细胞计数常增高 WBC 5 mm3 因此 脑脊液白细胞计数也常常是判断疗效的敏感指标 有条件的单位行脑脊液PCR检测 可以快速准确的诊断神经性梅毒 关于梅毒血清反应的假阳性 一 技术性假阳性 抗原敏感性过高 血清标本弄错或溶血或细菌污染 检查室技术不熟练 二 生物学假阳性 1 急性生物学假阳性 见于麻疹 水痘 风疹 传染性单核细胞增多症 上呼吸道感染 猩红热 亚急性细菌性心内膜炎 肺炎球菌性肺炎 活动性肺结核 丝虫病 斑疹伤寒 锥虫病 回归热 钩端螺旋体 疟疾 但滴度很低 一般在1 8以下 当用螺旋体抗原血清FTA ABS或TPHA试验检测 血清反应阴性 PCR检测阴性 2 慢性生物学假阳性 1 非螺旋体抗原血清试验假阳性 这些疾病常见于自身免疫性疾病 如系统性红斑狼疮 播散性盘状红斑狼疮 自身免疫性溶血性贫血 进行性系统性硬化症 类风湿性关节炎 风湿性心脏病 肝硬化 结节性多动脉炎 干燥综合征 慢性肾炎及海洛因成瘾 滴度可达1 64 1 128 少数孕妇 正常人群假阳性率为1 2 在70岁以上高龄老人中有1 出现假阳性 2 螺旋体抗原血清假阳性 发生率比非螺旋体抗原血清试验少 淋病 淋病 病因 是由淋球菌所引起的泌尿生殖系统化脓性疾病流行病学临床表现男性淋病女性淋病儿童淋病播散性淋球菌感染实验室检查 淋球菌培养是金标准防治 男性淋病 淋菌性尿道炎附睾炎淋菌性前列腺炎淋菌性咽炎成人淋菌性眼炎 淋菌性宫颈炎急性尿道炎前庭大腺炎急性输卵管炎盆腔炎肝周围炎 女性淋病 急性淋菌性尿道炎 女性淋菌性尿道炎 淋菌性宫颈炎 淋菌性前庭大腺炎 幼女淋菌性外阴阴道炎 淋病的实验室检查 一 涂片检查 革兰氏染色 取患者尿道分泌物或宫颈分泌物 作革兰氏染色 在多形核白细胞内找到革兰氏阴性双球菌 涂片对有大量脓性分泌物的单纯淋菌性前尿道炎患者 此法阳性率在90 左右 可以初步诊断 女性宫颈分泌物中杂菌多 敏感性和特异性较差 阳性率仅为50 60 且有假阳性 因此世界卫生组织推荐用培养法检查女病人 慢性淋病由于分泌物中淋球菌较少 阳性率低 因此要取前列腺按摩液 以提高检出率 免疫荧光 通过检测淋球菌外膜蛋白I的单克隆抗体作直接免疫荧光试验 淋球菌免疫荧光镜检 二 培养检查 淋球菌培养是诊断的重要佐证 培养法对症状很轻或无症状的男性 女性病人都是较敏感的方法 只要培养阳性就可确诊 在基因诊断问世以前 培养是世界卫生组织推荐的筛选淋病的唯一方法 目前国外推荐选择培养基有改良的Thayer Martin TM 培养基和NewYorkCity NYC 培养基 国内采用巧克力琼脂或血琼脂培养基 均含有抗生素 可选择地抑制许多其他细菌生长 在36 70 湿度 含5 10 CO2 烛缸 环境中培养 24 48小时观察结果 培养后还需进行菌落形态 革兰氏染色 氧化酶试验和糖发酵试验等鉴定 培养阳性率男性80 95 女性80 90 淋球菌培养 三 淋球菌的基因探针诊断 淋球菌的基因探针诊断 所用的探针有 质粒DNA探针 染色体基因探针和rRNA基因探针 1 质粒DNA探针 隐蔽质粒DNA探针 耐药性质粒DNA探针 2 染色体探针 染色体探针包括已知功能的基因探针 如菌毛DNA探针和paI基因探针 3 rRNA基因探针 rRNA基因探针是将与rRNA互补的DNA作为探针 rRNA基因探针可同时检测rRNA分子和DNA分子 四 淋球菌的基因扩增检测 普通PCR 1 淋球菌DNA的提取 培养菌的DNA提取 临床棉拭子标本的提取 2 PCR引物的设计 由于淋球菌隐蔽质粒CPPB基因在淋球菌染色体中和4 2kb隐蔽质粒中都有存在 同时在96 的淋球菌中都有该隐蔽质粒 因此很多PCR引物设计在CPPB基因区 3 PCR扩增 4 产物分析 扩增产物于2 的琼脂糖凝胶电泳30min 溴化乙锭染色 紫外灯下可见扩增的DNA荧光条带 分子大小应与所用引物扩增靶序列的大小一致 单管巢式PCR淋球菌连接酶链反应 LCP LCP在检测男性尿道棉拭子标本的灵敏度为100 尿液标本为88 9 女性宫颈棉拭子标本为95 4 LCP方法的特异性高达100 非淋菌性尿道炎 衣原体性尿道炎与淋菌性尿道炎鉴别 衣原体的实验室检查 衣原体细胞培养 对沙眼衣原体敏感的细胞株为McCoy细胞 Hela 229细胞和BHK细胞 最常用的是经放线菌酮处理的单层McCoy细胞 孵育后 用单克隆荧光抗体染色 可迅速诊断 但操作人员一定要熟练 需专业培养 培养法的敏感性为80 90 阳性即可确立诊断 衣原体细胞学检查法 在感染细胞内可有衣原体的包涵体存在 从感染部位采取细胞标本作涂片 姬姆萨染色包涵体是蓝色或暗紫色 碘染色显示褐色 但敏感性差 40 目前已较少采用 免疫荧光 近年来采用荧光素标记的抗衣原体单克隆抗体 来检测细胞涂片中的衣原体 使用较为方便 目前主要用衣原体外膜蛋白 MOMP 的单克隆抗体的商品试剂 MicoTrak Pathfinder Monofluor 结果判断 要衣原体数 10个才能判为阳性 支原体 支原体性尿道炎的实验室诊断 支原体培养 采集标本 注意部位 常用培养基为牛心浸液或蛋白胨 并含1 新鲜酵母浸液 10 20 动物血清及0 5 氯化钠 还可加葡萄糖和精氨酸以促进MH和MG生长 加入尿素以供UU代谢 适量加青霉素抑制杂菌 酶联免疫吸附试验 ELISA 及微量免疫荧光法 MIF 基因诊断 利用DNA探针对支原体诊断其敏感性稍差 但特异性高 用聚合酶链反应 PCR 敏感性 特异性均高 支原体感染的基因诊断 1 标本处理 1 取材 2 解脲脲原体DNA提取 2 引物设计引物来源于解脲脲原体 脲酶基因序列 UU1 CAGATACATTAAACGAAGCAGG 1613 1635 UU2 GTGGTGACATACCATTAAC 1837 1819 3 PCR扩增 4 扩增产物的检测 1 5 琼脂糖凝胶电泳检测 取10ulPCR扩增物作1 5 琼脂糖凝胶电泳 0 5 g ml溴化乙锭染色 以PGEM 3Zf DNA Hae 为分子量标准 置紫外透射仪观察结果 艾滋病 AIDS在世界范围内流行状况 世界卫生组织和联合国艾滋病联合规划署日前公布的报告表明 全球的艾滋病患者和病毒携带者总人数已经超过了3600万 自1981年发现首例艾滋病患者以来 这一 世纪杀手 已经夺去了2180万人的生命 仅在2000年全球就有530万人感染了艾滋病病毒 300万人因患艾滋病而死亡 其中240万人都是撒哈拉沙漠地区的居民 在被感染的530万人中 有60万人是15岁以下的儿童 我国AIDS流行状况 85年首次发现AIDS病人 目前我国艾滋病感染者约84万 其中病人8万 居亚洲第4位和世界第17位 疫情涉及全国31个省 自治区 直辖市 以沿海 沿边及大城市为主 传播日趋多样化 以静脉吸毒为主 经血液传播日益严重 经性传播逐年上升 逐步成为主要传播途径 艾滋病病毒感染人数迅速增加 流行上升速度加快 感染发病者以青壮年为主 占93 9 15 49岁 男性为主 男女比例4 6 1 感染人群涉及面广 其中农民数量占到70 以上 艾滋病病毒感染者和艾滋病病人由外籍人员转向国内公民 从出入境人员中发现感染者数量剧增 由高危人群向一般人群扩散 我省AIDS流行状况 山西1995年发现首例 目前累计报告艾滋病病毒感染者589例 运城市118例 其中艾滋病病人294例 死亡139例 病例分布在全省11个市地的54个县区 艾滋病感染者主要集中在农村地区 以青壮年为主 占到感染者总数的83 艾滋病临床表现 潜伏期 2 15年 平均8 10年急性感染 传单症状 早期 持续性淋巴结肿大中期 非特异性症状 鹅口疮 口腔毛状粘膜白斑 血小板减少性紫癜晚期 机会性感染及恶性肿瘤 艾滋病的实验室检查 一 免疫功能检测 CD4 T淋巴细胞耗竭 T淋巴细胞功能下降 外周血淋巴细胞显著减少 CD4 200 l CD4 CD8 1 0 正常人为1 25 2 1 二 HIV抗体检测1 酶联免疫吸附法 ELISA 2 明胶颗粒凝集试验 PA 3 金标法4 免疫荧光检测法 IFA 5 免疫印迹检测法 WesternBlot法 6 放射免疫沉淀法 RIP 其中前三项常用于筛选试验 后二者用于确证试验 三 PCR技术检测HIV病毒意义 疑有HIV感染但又缺乏确切的血清学依据的人群 如上述的HIV阳性母亲所生的婴儿 阳性患者的性伴侣 静脉吸毒者和可疑的血清反应者 PCR技术还可用来检测血液制品及疫苗中有无HIV 1 标本的采集与模板核酸的制备 方法 模板核酸的提取 1 从外周血单核细胞中提取DNA 2 从外周血单核细胞中提取RNA及其反转录PCR扩增 一 引物的设计与合成 二 PCR扩增步骤扩增产物的检测和分析 扩增产物的检测和分析可采用凝胶电泳 限制性内切酶图谱 DNA序列分析及分子杂交等技术 四 HIV病毒分离 P3实验室 尖锐湿疣的实验室检查 醋酸白试验免疫组织学检查常用过氧化物酶抗过氧化物酶方法 即PAP 显示湿疣内的病毒蛋白 以证明疣损害中有病毒抗原 HPV蛋白阳性时 尖锐湿疣的浅表上皮细胞内可出现淡红色的弱阳性反应 组织化学检查病理检查基因诊断HPV DNA扩增 一 细胞学