5-基因工程及其在食品中的应用-修改版.PPT.ppt

第二章基因工程及其在食品工业中的应用 黃金米 富含铁质 含胡萝卜素 一般白米 转基因植物与农作物的抗性 中国抗病毒白菜 抗虫玉米 抗除草剂 耐储转基因农作物 耐储 转基因植物 瑞士金大米 烟草 双抗 石竹 棉花 荧光蘑菇 转基因动物 荧光斑马鱼 荧光猪 硕鼠 绿荧光猴 鲑鱼 基因工程疫苗 转基因烟草能够产生狂犬病抗体 美国含乙肝疫苗马铃薯 墨防腹泻蔬菜 第一节基因工程的工具酶第二节目的基因第三节基因工程的载体第四节基因重组第五节转化 增殖和表达第六节基因工程在食品工业中的应用第七节蛋白质工程第八节基因工程食品卫生安全管理条理 教学内容 Geneengineering 从狭义上讲 基因工程 又称DNA重组技术 DNARecombination 是指将一种或多种生物体 供体 的基因与载体在体外进行拼接重组 然后转入到另一种生物体 受体 内 使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状 通过基因工程获得新性状的生物体微生物称为 工程菌新类型的动物称为 工程动物 转基因动物 新类型的植物称为 工程植物 转基因植物 从广义上讲 基因工程定义为DNA重组技术的产业化设计与应用 包括上游技术和下游技术两大部分 上游技术指外源基因重组 克隆和表达的设计和构建 即狭义的基因工程 下游技术指含有外源基因的生物细胞的大规模培养以及外源基因表达产物的分离纯化过程 基因工程操作的基本过程 大致可以分为以下几个步骤 1 从供体细胞中分离出基因组DNA 或合成基因 用限制性内切酶分别将外源DNA 包括外源基因或目的基因 和载体分子切开 简称切 2 用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片段接到载体分子上 形成DNA重组分子 简称接 3 借助于细胞转化手段等手段将DNA重组分子倒入受体细胞 简称转 4 短时间培养转化细胞 以扩增DNA重组分子或使其整合到受体细胞的基因组中 简称增 5 筛选和鉴定转化细胞 获得使外源基因高效稳定表达的基因工程菌或细胞 简称检 第一节基因工程工具酶 工具酶 Enzymeoftools 在基因工程中应用的酶统称为 包括体外进行DNA合成 切割 修饰和连接等系列过程中所需要的酶 如DNA聚合酶 限制性内切酶 修饰酶和连接酶等等 目前 常用的工具酶已有300多种 一限制性内切酶 限制性内切酶 restrictionendonuclease 是一类以环状或线形双链DNA为底物 能识别DNA中特定核苷酸序列 并在合适反应条件下使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶 1 限制性内切酶的类型及特性分为三种类型 型 型和 型 是根据分离出此酶的微生物的学名而定的 命名原则 取微生物属名的第一个字母和种名的前两个字母组成三个斜体字母加以表示 菌株名以非斜体字母再加在后面 如果同一菌株中先后发现几种不同的限制性内切酶 则用罗马数字加以表示 例 EcoR E 来源于Escherichiacoli的属名的第一个字母Co 来源于Escherichiacoli的种名的头两个字母R 表示株名 表示该菌中第一个被分离出来的酶 2 限制性内切酶的命名 3 限制性内切酶的作用机制 限制性核酸内切酶以环状和线形的双链DNA为底物 在合适的反应条件下 识别一定的核苷酸序列 使两条核糖链上特定位置的磷酸二酯键断开 产生具有了3 OH基团和5 P基团的片段 限制性内切酶在双链DNA上能够识别的特殊核苷酸序列被称为识别序列 不同的限制性内切酶各有相应的识别序列 现在发现的限制性内切酶的识别序列多数由4 5 6个核苷酸组成 4 限制性内切酶的识别序列 EcoR 的识别序列是 GAATTCCTTAAGHind 的识别序列是 AAGCTTTTCGAASau3A的识别序列是 GATCCTAG它们具有共同的特点 即呈现碱基互补对称 识别序列可以按从5 3 走向的单链DNA表示 如5 AAGCTT3 3 TTCGAA5 可以写成5 AAGCTT3 5 限制性内切酶切割DNA的位点和切割片段的末端 DNA在限制性核酸内切酶的作用下 使多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置被称为切割位点 表示方法 或 限制性核酸内切酶在DNA上切割的位点一般在识别序列内部 如GGATCC等 少数限制性内切酶在DNA上的切割位点在识别序列的两侧 如GATC等 经限制性核酸内切酶切割产生的DNA片段末端 两种形式 1 粘性末端 一类是两条DNA链断开的位置是交错对称的 产生的DNA片段末端的一条链多出1至几个核苷酸 同具有互补核苷酸的另一DNA片段末端可以粘结 这样的DNA片段末端称为粘性末端 2 平末端 两条链上断裂的位置处在识别序列的对称结构中心 产生的DNA末端是平齐的 称为平末端 二 DNA连接酶 DNA连接酶 DNAligase 能催化两个DNA片段末端之间的3 OH和5 P基团形成磷酸二酯键 使两末端连接的酶称为 种类 大肠杆菌DNA连接酶 E coliDNA连接酶 T4 DNA连接酶 大肠杆菌DNA连接酶只能连接具有互补粘性末端的DNA片段 反应系统中必须含有NAD作为辅助因子 T4 DNA连接酶即可以用于双链DNA片段互补粘性末端之间的连接 也能催化双链DNA片段平末端之间的连接 但平末端之间连接的效率比较低 反应系统中必须加有ATP作为辅助因子 三 DNA聚合酶 常使用的DNA聚合酶有 大肠杆菌DNA聚合酶 和T4DNA聚合酶等 DNA聚合酶的共同特点 能把脱氧核糖核苷酸连续加到双链DNA分子引物链的3 OH末端 催化核苷酸的聚合 大肠杆菌DNA聚合酶 的5 3 的DNA聚合活性 催化单核苷酸结合到DNA模板的3 OH末端 以单链DNA为模板 从引物的3 末端按模板顺序从5 3 延伸 CCGE coliDNApol CCGATAGCCTGGCTATCGGAMg2 4dNTPGGCTATCGGA 目前采用的碱性磷酸酯酶有两种 1 细菌碱性磷酸酯酶 BAP 2 小牛肠碱性磷酸酯酶 CIP 碱性磷酸酯酶能催化从单链或双链DNA或RNA分子中除去5 磷酸残基 即脱磷酸作用 使DNA或RNA末端的5 P成为5 OH 四 碱性磷酸酯酶 在基因工程中的应用 1 在DNA重组技术中除去DNA片段的5 磷酸 防止自身环化 2 在用32P标记DNA的5 磷酸末端之前 除去磷酸 T4多聚核苷酸激酶 能催化ATP上的 磷酸转移到DNA或RNA的5 OH末端上 使其磷酸化 主要作用是为DNA的5 末端标记 标记待测的DNA片段 ATP上的 磷酸是放射性的 五 T4多聚核苷酸激酶 S1核酸酶 其主要特征是降解单链DNA或RNA 包括不能形成双链的区域 如发夹结构中的环状部分 但降解DNA的速度大于降解RNA的速度 降解反应的方式为内切和外切 当酶量过大时会伴有双链DNA的降解 在基因工程中应用 常用它切平DNA双链中突出的单链末端 使产生平末端 在质粒组建和DNA重组中被广泛使用 六 S1核酸酶 S1Nuclesse 反向转录酶 Reversetranscriptase 能以RNA为模板 反向转录合成出对应的DNA 单链或双链 因此 通过反向转录酶的作用 可以从某一基因的mRNA来合成出该基因 以获得目的基因 反向转录酶也能以DNA为模板合成DNA 七 反向转录酶 目的基因 按照人们预先设计的蓝图 获得所需要的特异基因 即 目的基因主要是编码蛋白质 酶 的结构基因 如抗逆性相关基因 工业用酶相关基因 生物药和保健品相关基因 毒物降解相关基因等 第二节目的基因 分离目的基因的方法 1 鸟枪法 Shotgun 2 酶促合成法3 化学合成法 以目的基因的mRNA为模板 在反向转录酶的作用下合成互补的DNA 即cDNA complementaryDNA 然后在DNA聚合酶的催化下合成双链cDNA片段 与适当的载体重组后转入受体菌中扩增 获得目的基因的cDNA克隆 mRNA cDNA dscDNA 2 酶促合成法 DNA或RNA序列的合成 按照已知基因的碱基顺序 将单核苷酸或核苷酸片段一个一个或一个片段一个片段地聚合起来 一般先合成DNA短片段 再依次连接成完整的目的基因链 目前 化学合成寡核苷酸片段的能力一般局限在150 200bp以内 这种方法适合分子较小的基因的合成 3 化学合成法 基因克隆载体 genecloningvector 把能承载外源DNA片段 基因 并将其带入受体细胞的传递者称为 基因载体必须具备的几个条件 书上P19 本身是一个复制子 能自我复制 相对分子量要小 小分子易处理 限制性内切酶切点少 适于接受目的基因 酶切位点应位于载体复制的非必需区 第三节 基因载体 能给寄主细胞 受体细胞 提供可选择性标记 可供辨认的表型特征 以便人们进行筛选 克隆载体必须是安全的 目前应用的基因载体 质粒载体 噬菌体载体和病毒载体 以及由它们互相组合或与其他基因组DNA组合而成的载体 质粒载体 以质粒DNA为基础构建而成的载体 质粒 是一种存在于宿主细胞中染色体以外的裸露的双链DNA分子 一个质粒就是一个DNA分子 一 质粒载体 根据质粒在寄主细胞中拷贝数的多少 将质粒分为两种类型 即严紧型质粒和松弛型质粒 严紧型质粒 拷贝数少的 只有 至几个拷贝 称之严紧型质粒 松弛型质粒 拷贝数多的 10个拷贝以上 一般10 200 有的能复制几百个或上千个拷贝 称之松弛型质粒 构建质粒载体一般选用分子小和松弛型的质粒 构建的质粒载体应具有复制起始点 能在受体细胞内复制 质粒载体还应有1 2种选择标记基因 如抗生素的抗性基因Amr 青霉素抗性 Tcr 四环素抗性 等 另外质粒上有允许外源DNA组人的克隆位点 通常可采用这两种方法 选择性抽提法用溶菌酶溶菌 形成的细胞碎片因染色体DNA与质粒DNA有相对分子质量上的差异 用高速离心方法而分离 上清液经乙醇沉淀后可得到质粒DNA的粗制品 质粒DNA的分离提取方法 碱性SDS法 sodiumdodecylsulfate 十二烷基硫酸钠 先用碱性SDS pH12 0 12 6 处理含有质粒的宿主细胞 然后用NaAc pH 4 8 处理 使混合液的pH降低到7 0左右 使质粒选择性地复性 而染色体DNA随同SDS和蛋白质一起沉淀下去 再经高速离心将质粒DNA留在上清液而达到分离的目的 纯化方法 碱性蔗糖密度梯度离心法 氯化铯 溴化乙锭密度梯度离心法 硝酸纤维素膜吸附法鉴定方法 凝胶电泳法 电镜法 质粒DNA纯化和鉴定方法 噬菌体 Phage 是病毒的一种 把感染细菌的病毒专门称为噬菌体 二 噬菌体载体 噬菌体载体 由噬菌体构建的基因载体叫 能作为基因载体的噬菌体主要是 噬菌体 Fall 2001 Biotech 50 噬菌体是比细菌还小得多的微生物 和病毒侵犯真核细胞一样 噬菌体侵犯细菌 也可以认为它是细菌里的 寄生虫 它本身是一种核蛋白 核心是一段DNA 结构上有一个蛋白质外壳和尾巴 尾巴上的微丝可以把噬菌体的DNA注入细菌内 Fall 2001 Biotech 51 侵犯细菌时 只是DNA侵入 然后利用细菌的酶来复制 转录 翻译 入侵E coli后 可以按裂解或建立溶原两种生活方式生存和繁殖 图左示 噬菌体在宿主内进行独立复制 在1个菌体内生长出100个左右的新噬菌体 并冲破 杀死 细菌释放出来 再度感染其它活菌 称为裂解 噬菌体侵入菌体后 把自身DNA加进细菌DNA里 整合 作为细菌基因的一部分 随菌的细胞分裂而增殖 这种生活状态称为溶原 lysogen Fall 2001 Biotech 52 噬菌体的生活周期 裂解 侵入细菌 独立复制 裂解 冲破细胞膜 再感染其他细菌 Fall 2001 Biotech 53 Fall 2001 Biotech 54 噬菌体的结构和用途 噬菌体线性双链DNA病毒 具有末端互补的12nt 感染细菌后粘端互补成双链环状 全长48531bp 含50多个基因 Fall 2001 Biotech 55 噬菌体基因组的结构在 噬菌体线性双链DNA分子的两端 各有一条由12个核苷酸组成的彼此完全互补的5 单链突出序列 即通常所说的粘性末端 注入到感染寄主细胞内的 噬菌体的线性DNA分子 会迅速地通过粘性末端之间的互补作用 形成环形双链DNA分子 随后在DNA连接酶的作用下 将相邻的5 P和3 OH基团封闭起来 并进一步超螺旋化 这种由粘性末端结合形成的双链区段称为cos位点 略语cos 系英语cohesive endsite的缩写 即粘性末端位点之意 在环化的状态下 噬菌体DNA分子的长度为48502碱基对 Fall 2001 Biotech 56 噬菌体基因大致分为4个区 结构区A J19个基因 编码头 尾部蛋白质为结构区 重组区att attachment int intagrate 及xis excission 调控区启动子 终止子和N CI基因 O R为裂解区 Fall 2001 Biotech 57 左侧区包括使噬菌体DNA成为一个成熟的 有外壳的病毒颗粒所需的全部基因 全长约20kb右侧区内包含所有的调控因子 与DNA复制及裂解宿主菌有关的基因 这个区域约长12kb 中间区域约长18kb 这一段DNA可以被外源置换而不会影响噬菌体 裂解生长的能力 置换型噬菌体 是使用最广泛的载体 Fall 2001 Biotech 58 噬菌体载体的构建 构建 噬菌体载体的基本原理构建 噬菌体载体的基本原理是多余限制位点的删除 野生型噬菌体 DNA全长约50kb 上有65种限制酶酶切点 除Apa Nae Nar Nhe SnaB Xba 和Xho 等7种限制酶各有一个切点外 其余都多于2个 有些酶切点在 增殖所必需的基因区域内 因此 噬菌体 必须经过改造才能用作载体 现在用的 载体大都除去了某种限制酶的酶切点 因此 作为载体的噬菌体 都短于野生型 Fall 2001 Biotech 59 按照这一基本原理构建的 噬菌体的派生载体 可以归纳成两种不同的类型 一种是插入型载体 insertionvectors 只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点 另一种是替换型载体 rePlacementvectors 具有成对的克隆位点 在这两个位点之间的 DNA区段可以被外源插入的DNA片段所取代 Fall 2001 Biotech 60 Fall 2001 Biotech 61 Fall 2001 Biotech 62 在基因克隆中的二者的用途不尽相同 插入型载体只能承受较小分子量 一般在10kb以内 的外源DNA片段的插入 广泛应用于cDNA及小片段DNA的克隆 而替换型载体则可承受较大分子量的外源DNA片段的插入 所以适用于克隆高等真核生物的染色体DNA Fall 2001 Biotech 63 噬菌体的体外包装 DNA的体外包装作用 在离体条件下 将重组体DNA包入噬菌体等病毒颗粒中的过程 以形成有功能的病毒载体 根据体外互补作用研究发现 噬菌体的头部和尾部的装配是分开进行的 头部基因发生了突变的噬菌体只能形成尾部 而尾部基因发生了突变的噬菌体则只能形成头部 将这两种不同突变型的噬菌体的提取物混合起来 便能够在体外装配成有生物活性的噬菌体颗粒 这就是噬菌体体外包装所依据的基本原理 Fall 2001 Biotech 64 Fall 2001 Biotech 65 噬菌体DNA的包装限制问题 噬菌体头部外壳蛋白质容纳DNA的能力是有一定限度的 上限不得超过其正常野生型DNA总量的5 左右 而低限又不得少于正常野生型DNA总量的75 按野生型 DNA分子长度为48kb计算 噬菌体的包装上限是51kb 编码必要基因的DNA区段占28kb 因此 载体克隆外源DNA的理论极限值应是23kb Fall 2001 Biotech 66 人工构建的含有 DNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体 粘粒载体cosmid Fall 2001 Biotech 67 能容纳大片段 45kb 的小分子 4kb 6kb 载体 组成 质粒复制原点 抗药基因 多克隆位点 已连接入的 cos位点 Fall 2001 Biotech 68 Cosmid载体特点 具有 噬菌体的特点具有质粒载体的特性高容量的克隆能力31 45kb具有与同源序列的质粒进行重组的能力 Fall 2001 Biotech 69 单链噬菌体载体M13 最常用的单链噬菌体载体是M13和它的改建噬菌体 M13是丝状噬菌体 有长约6500个核苷酸的闭环DNA基因组 M13附着在大肠杆菌的F性菌毛上 所以它们只能感染雄性细菌 即F 或Hfr细菌 当噬菌体进入细菌细胞后 单链的噬菌体DNA转变成双链复制型 RF 从细胞中分离的RF可用作克隆双链DNA的载体 当每个细菌细胞里积聚了200到300份RF型拷贝时 M13开始不对称的合成 即只大量合成DNA双链中的一条链 单链DNA掺入成熟的噬菌体颗粒 颗粒不断地从感染细胞上芽生 M13感染虽不杀死细胞 但细胞的生长受到一定的抑制 所以形成混浊的噬菌斑 Fall 2001 Biotech 70 Fall 2001 Biotech 71 单链噬菌体载体的优点 M13的感染与释放不会杀死宿主菌 仅导致宿主菌生长缓慢 M13DNA在宿主菌内既可以是单链也可以是双链 M13的包装不受DNA大小的限制 其噬菌体颗粒的大小可随DNA的大小而改变 即使DNA的大小比本身DNA的大小超出6倍 仍能进行包装 由于M13的这些特性 而使之广泛地用于DNA重组 Fall 2001 Biotech 72 M13的基因组中除有一段507个核苷酸 其余都含有与其复制有关的遗传信息 因此 只有在这一段中可插入外源DNA而不致影响噬菌体的活性 插入M13的外源DNA超1000bp时就不稳定 在噬菌体增殖时会出现缺失 一般说 插入300 400bp是相当稳定的 Fall 2001 Biotech 73 噬菌粒载体 噬粒 phagemid或phasmid 是由质粒载体和单链噬菌体载体构建成的 它们既有质粒的复制起点 又有噬菌体的复制起点 因此 在大肠杆菌细胞里 可以按正常的双链质粒分子进行复制 生成双链DNA 当存在辅助噬菌体的条件时 在噬菌体基因 蛋白质的作用下 又可像单链噬菌体M13一样按滚环模型复制出单链DNA 并在包装成噬菌体颗粒后释放出宿主细胞 最为常用的噬粒载体有pUC118和pUCll9 两者除了多克隆位点的序列正好相反外 其余的序列都是相同的 Fall 2001 Biotech 74 Fall 2001 Biotech 75 pUC118 pUC119的优点 分子量小 可以克隆高达10Kb的外源片段 并且易于体外分离与操作带有ampr抗性标记拷贝数高 可达500个存在一个多克隆位点区lacZ基因5 端编码区质粒的复制起点 Fall 2001 Biotech 76 M13的复制起点 ssDNA 包装 分泌到培养基pUC118 pUC119方向相反 转录正链 负链可以直接测序 Fall 2001 Biotech 77 Fall 2001 Biotech 78 病毒载体 猴病毒40 SV40 猴病毒40 SV40 的基因组常用来作为克隆载体 把外源DNA转入哺乳类细胞 猴病毒40是球形动物病毒 直径40nm 呈20面体 有一个共价闭环的双链DNA基因组 全长5244bp 它在猴肾中增殖 被SV40感染的细胞都会出现SV40的T抗原 早已证明完整的小鼠染色体 珠蛋白基因 包括所有的间插顺序和两侧顺序 整合在SV40中后 在被感染的猴肾细胞中都能正确地转录和翻译 表明猴肾细胞的拼接系统能有效地处理小鼠 珠蛋白的初级转录本 可是 SV40作为克隆载体有其局限性 SV40基因组的晚期功能区的裂解性 不利于外源DNA的重组和表达 早期功能区与病毒的致癌性有关 使用时有顾虑 重组DNA片段的大小受体限制 Fall 2001 Biotech 79 逆转录病毒逆转录病毒是RNA病毒 它有三个基因 gag 编码病毒的核心蛋白 pol 编码逆转录酶 env 编码病毒的被膜糖蛋白 有的逆转录病毒还带有癌基因 vonc 即有的逆转录病毒有致癌作用 近年来 已设计构建成一些缺陷型病毒 defectivevirus 使逆转录病毒成为有用的基因载体 成功地把抗药性基因转入了人体造血前体细胞 并在细胞中表达 Hock等选用了缺失编码病毒外壳蛋白基因的逆转录病毒 因此不能合成自身的外壳 但它有识别外壳蛋白进行包装的信号 一段尚未鉴定的DNA顺序 用这种缺陷的逆转录病毒去感染某种细胞株 这种细胞株包含有辅助病毒 helpervirus 辅助病毒能合成蛋白外壳 但缺失了识别蛋白外壳进行包装的信号 因此它不能包装成病毒颗粒 当用逆转录病毒感染细胞株后 逆转录病毒的RNA进入辅助病毒的外壳蛋白 成为病毒颗粒 这时把受感染的细胞同骨髓细胞一起培养 包装在辅助病毒外壳蛋白中的逆转录病毒RNA 进入骨髓细胞 病毒DNA插入宿主细胞基因组 基因的活性得到表达 这时 由于骨髓细胞里面没有辅助病毒 所以整合进宿主基因组的逆转录病毒 不再有外壳蛋白可供包装 因此也就无法增殖 而只能被 陷 在宿主基因组中 通过细胞分裂而传给下一代子细胞 Fall 2001 Biotech 80 T载体 Fall 2001 Biotech 81 MCS Fall 2001 Biotech 82 T vector两条链的3 端含有一个游离的TPCR过程中 普通的Taq酶可在产物的3 端多加一个A T A克隆 Fall 2001 Biotech 83 Fall 2001 Biotech 84 表达载体 expressingvector 特点 带表达构件 转录和翻译所需的DNA序列大肠杆菌表达载体 含启动子 核糖体结合位点 克隆位点 转录终止信号启动子 trp lac tac 启动子 噬菌体PL启动子 T7噬菌体启动子核糖体结合位点 ribosome bindingsite RBS 起始密码子 ATG 和SD序列转录终止序列 Fall 2001 Biotech 85 Fall 2001 Biotech 86 Fall 2001 Biotech 87 Fall 2001 Biotech 88 哺乳动物表达载体 真核表达元件 启动子 增强子 克隆位点 终止信号和加poly A 信号 Fall 2001 Biotech 89 哺乳动物表达载体 真核表达元件 启动子 增强子 克隆位点 终止信号和加poly A 信号 Fall 2001 Biotech 90 重组DNA技术的基本过程 目的基因的制备载体的选择和制备DNA分子的体外连接将外源DNA导入宿主细胞目的基因的筛选和鉴定 Fall 2001 Biotech 91 目的基因 targetDNA 的制备 目的基因 外源基因 制备基因组DNA基因文库 genomiclibrary 存在于转化细菌中 克隆载体携带的所有基因组DNA的集合制备cDNAcDNA文库 cDNAlibrary 制备用于表达的基因片段 PCR技术 化学合成 Fall 2001 Biotech 92 Fall 2001 Biotech 93 Fall 2001 Biotech 94 Fall 2001 Biotech 95 Fall 2001 Biotech 96 Fall 2001 Biotech 97 载体的选择和制备 噬菌体 粘性质粒 pUC系列 M13噬菌体DNA分子的体外连接 DNA连接酶 粘性末端连接连接效率高相同酶切末端平端连接连接效率低人工接头 linker 法同聚物接尾法 Fall 2001 Biotech 98 Fall 2001 Biotech 99 Fall 2001 Biotech 100 Fall 2001 Biotech 101 Fall 2001 Biotech 102 同聚物接尾法 Fall 2001 Biotech 103 将外源DNA导入宿主细胞 基因工程菌HB101 JM109转化 transformation 制备感受态细胞冷的氯化钙处理 细胞处于最适摄取和容忍外来DNA的生理状态感染 infaction 转导 transduction 由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息转移过程转染 transfection 真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程 Fall 2001 Biotech 104 目的基因的筛选和鉴定 screening selection 遗传学方法插入灭活法 insertioninactivation 抗药性标志选择标志补救表达产物与营养缺陷互补 互补蓝白斑筛选免疫学方法分子杂交探针原位杂交PCR限制性酶切图谱 Fall 2001 Biotech 105 乳糖操纵子的天然诱导物是乳糖乳糖类似物异丙基 D 硫代半乳糖苷 IPTG 有更强的诱导作用 IPTG配合使用在基因工程可作蓝白斑筛选 X gal5 溴 4 氯 3 吲哚 D 半乳糖苷LacZ基因编码的半乳糖苷酶X gal蓝色吲哚产物 蓝白斑试验 IPTG Xgal试验 Fall 2001 Biotech 106 ZYX P O ZYX P O 乳糖 Fall 2001 Biotech 107 标志补救 半乳糖苷酶法 lacZ Fall 2001 Biotech 108 Fall 2001 Biotech 109 LacZ基因N端序列 插入片段 LacZ基因失活 LacZ基因N端序列 LacZ酶 Fall 2001 Biotech 110 Fall 2001 Biotech 111 Fall 2001 Biotech 112 Fall 2001 Biotech 113 IPTG X gal 5 溴 4 氯 3 吲哚 D 半乳糖苷 Fall 2001 Biotech 114 Fall 2001 Biotech 115 Fall 2001 Biotech 116 PCR扩增技术 多聚酶链式反应 Polymerasechainreaction PCR 是一种在体外快速扩增特定DNA序列的新技术 PCR技术的本质 是根据生物体DNA的复制原理在体外合成DNA 这个反应需要DNA单链模板 引物 DNA聚合酶以及缓冲系统 PCR扩增技术 PCR扩增DNA特定靶序列的一个前提条件 是必须知道待扩增DNA区域两端16 24bp的序列 由此合成两种引物 引物 是PCR扩增过程中引导互补链DNA合成的一种脱氧核苷酸寡聚体 其3 端必须具有游离的 OH基团 引物与所要扩增的靶DNA片段的末端互补 与模板DNA相结合并沿模板DNA延伸 以扩增靶DNA序列 1 将待扩增双链DNA加热变性 形成单链模板 2 加入两种不同的单链DNA引物 并分别与两条单链DNA模板退火 3 DNA聚合酶从两个引物的3 羟基端按照模板要求合成新生DNA链 构成一轮复制反应 重复上述操作n次 理论上即可从1分子的双链DNA扩增到2n个分子 IPCR扩增DNA的反应包括三步程序 第六节基因工程在食品工业中应用 一 改良食品加工的原料动物性原料 1 应用基因工程提高奶牛的产奶量将采用基因工程技术生产的牛生长激素 bovinesomatotropin BST 注射到母牛体内可提高母牛产奶量 2 改善食用肉的质量 植物性食品原料 如基因工程改造过的马铃薯 大豆 芥花菜 番茄等 二 改良微生物菌种性能第一个采用基因工程改造的食品微生物为面包酵母 saccharomycescerevisiae 由于把具有优良特性的酶基因转移至该菌中 使该菌含有的麦芽糖透性酶及麦芽糖酶的含量比普通面包酵母高 在面包加工中产CO2的量高 三 应用于酶制剂的生产凝乳酶 chymosin 是第一个应用基因工程技术把小牛胃中的凝乳酶基因转移至细菌或真核微生物中生产的一种酶 1990年美国FDA已批准使用在干酪生产上 目前 英 美等国相继构建了各自的凝乳酶原的cDNA文库 基因组文库 包含某种生物基因组全部