动物细胞培养.ppt

细胞培养 细胞培养的相关概念 细胞培养 细胞培养是指从体内组织取出细胞摹拟体内出现环境 在无菌 适当温度及酸碱度和一定营养条件下 使期生长繁殖 并维持其结构和功能的一种培养技术 传代 细胞在培养器皿中生长一定时间后 被分开接种到新的培养器皿中 原代培养 从动物机体取出的进行培养的细胞群 除肿瘤细胞以外 原代培养的细胞生长比较缓慢 而且繁殖一定的代数后 一般10代以内 停止生长 传代培养 将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶即称为传代或传代培养 分离一次再培养称为传一代 细胞系 从肿瘤组织培养建立的细胞群或培养过程中发生突变或转化的细胞 在培养条件下可无限繁殖 细胞株 从原代培养或细胞系中获得的有特殊性质或标志的细胞 在培养过程中其特征始终保持 一 培养细胞的特性 一 培养细胞的特性1 培养细胞的生长方式贴附生长 必须贴附于支持物表面才能生长 是多数体外培养细胞的基本生长特点 见于各种实体瘤细胞 虽然血细胞如淋巴细胞在活体体内并无聚集的倾向并在体外可于悬浮状态中生长 但是大多数的哺乳动物细胞在体内和体外均附着于一定的底物而生长 接触抑制及密度依赖性悬浮生长 于悬浮状态下即可生长 不需要贴附于支持物表面 见于各种造血系统肿瘤细胞 常用培养容器 细胞培养瓶 微孔板 平皿等 贴壁生长细胞传代方法 1 吸光培养瓶中的培养液 2 加入1 2ml0 25 的胰蛋白酶液 以消化液能覆盖整个瓶底为准 静置2 10min 显微镜下动态监测 3 吸去胰蛋白酶液 加入培养液 4 用吸管吸取瓶内培养液 反复吹打瓶壁细胞 形成细胞悬液 5 吸取适量细胞悬液 接种于新的培养瓶内 6 加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内 7 将后者放入培养箱中培养 细胞传一代后 一般要经过以下三个阶段 1 潜伏期 LatentPhase 细胞接种培养后 先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期 此时细胞胞质回缩 胞体呈圆球形 接着是细胞附着或贴附于底物表面上 称贴壁 悬浮期结束 各种细胞贴附速度不同 这与细胞的种类 培养基成分和底物的理化性质等密切相关2 指数增生期 LogarithmicgrowthPhase 这是细胞增值最旺盛的阶段 细胞分裂相增多 指数增生期是细胞一代中活力最好的时期 因此是进行各种实验最好的和最主要的阶段 在接种细胞数量适宜情况下 指数增生期持续3 5天后 随细胞数量不断增多 最后细胞相互接触汇合成片 如培养的是正常细胞 相互接触能抑制细胞的增殖 这种现象称接触抑制 ContactInhibition 而恶性细胞则无接触抑制现象 因此接触抑制可作为区别正常与癌细胞标志之一 肿瘤细胞由于无接触抑制能继续移动和增殖 导致细胞向三维空间扩展 使细胞发生堆积 Piledup 3 停滞期 StagnatePhase 细胞数量达饱和密度后 细胞遂停止增殖 进入停滞期 此时细胞数量不再增加 故也称平顶期 Plateau 停滞期细胞虽不增殖 但仍有代谢活动 继而培养液中营养渐趋耗尽 代谢产物积累 pH降低 此时需做分离培养即传代 细胞生长过程 人微血管内皮细胞株 HMEC 1 细胞状态特征 多角形或梭形 边界清晰 大小均匀 胞核为圆形或椭圆形 位于细胞中央 汇合后呈典型的铺路石样排列 人口腔皮样癌KB细胞株细胞状态与特征简述 贴壁生长细胞 呈不规则形状 二 培养细胞生长的条件 1细胞的营养需要培养基 提供细胞培养氨基酸 维生素 碳水化合物 无机离子 生长因子等 2细胞的生存环境温度 人类细胞一般用37 气相及pH 95 空气加CO2的混合气体 pH 7 2 7 4 CO2为细胞生长所需要 同时又是细胞代谢的产物 并与维持培养基的pH有关 3渗透压 因细胞的类型及种族而异 4无污染及无毒 无毒是培养细胞的必须条件 凡与细胞直接或间接接触者 若具细胞毒性 都会导致细胞的死亡 污染问题包括细菌等微生物的污染 不同细胞类型的交叉污染及上述有害物质的污染 肿瘤细胞的培养 肿瘤细胞 tumorcell 在组织培养中占有核心的位置 首先癌细胞是比较容易培养的细胞 当前建立的细胞系中 癌细胞系是最多的 另外 癌症是对人类威胁最大的疾病 肿瘤细胞培养是研究癌变机理 抗癌药检测 癌分子生物学极其重要的手段 肿瘤细胞培养对阐明和解决癌症将起着不可估量的作用 取材 人肿瘤细胞来自外科手术或活检瘤组织 取材部位非常重要 癌性转移淋巴结活胸腹水是好的培养材料 取材后宜尽快进行培养 如因故不能立即培养 贮存于4 但不宜超过24小时 培养基肿瘤细胞对培养基的要求不如正常细胞严格 一般常用的RPMI1640 DMEM等均可 肿瘤细胞对血清的需求比正常细胞低 正常细胞不加血清不能生长 肿瘤细胞在低血清培养基中也能生长 肿瘤细胞对培养环境适应性较大 是因为肿瘤细胞有自分泌 Autocrine 性产生促生长物质之故 但这并不说明肿瘤细胞完全不需要这些成分 大多数肿瘤细胞培养中仍需要生长因子 生物学鉴定主要有 形态学观察 异体动物 以用裸鼠为上 接种成瘤 软琼脂培养 核型分析 细胞骨架和电镜观察等 人胃癌细胞株SGC7901呈梭形贴壁生长 人白血病细胞K562悬浮细胞 规则 圆形 细胞培养室的设备 CO2培养箱 5 CO2 T36 5 0 5 电热鼓风干燥箱 烘干和干热消毒 80 冰箱 培养用的溶液 4 20 和 80 显微镜 倒置显微镜水纯化装置过滤除菌装置细胞冷冻储存器 液氮罐 80 超低温冰箱离心机 天平 电动吸液器和加样器细胞计数板和电子细胞计数仪pH计高压蒸汽消毒装置 培养用品的清洗和消毒灭菌 玻璃 浸泡 刷洗 洗洁精 烘干 铬酸过夜 水冲洗20遍 蒸馏水去离子水分别冲洗一遍 烘干胶塞 瓶盖 浸泡 刷洗 洗洁精 烘干 蒸馏水煮沸10min 烘干消毒灭菌 高温湿热灭菌121 20min 培养用液 a 水 去离子水 主要用于清洗 配制溶液 培养箱用水 b PBS缓冲溶液 维持渗透压 调节pH值以及供给细胞生存所需的能量和无机离子成分 主要作为配制溶液的基础液及用于洗涤组织 细胞等 c 胰酶消化液 0 25 胰蛋白酶溶液 其功能主要使细胞间的蛋白质水解 细胞分散 培养基 一般由合成培养基 血清 双抗组成合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量 用人工方法模拟合成的 目前已设计出许多种培养基 如TC199 MEM RPMI 1640 DMEM等 血清中含有促细胞成长因子多种复杂成分 支持细胞生长一般需加10 血清 血清质量好坏是实验成败的关键 抗菌素通常是青霉素和链霉素联合使用 称作双抗 四唑盐 MTT 比色法 四唑盐 MTT 商品名为噻唑蓝 四唑盐比色法的原理 活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物 formazan 并沉淀在细胞中 而死细胞没有这种功能 二甲亚砜 DMSO 能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物 溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比 再用酶标仪测定OD值MTT法简单快速 准确 广泛应用于新药筛选 细胞毒牲试验 肿瘤放射敏感性实验等 操作步骤 1 单细胞悬液接种于96孔培养板 4000 6000细胞 孔 每孔培养