高效液相色谱法(2).ppt

1 仪器分析 第18章高效液相色谱法Highperformanceliquidchromatography HPLC 2 2 高效液相色谱法的主要类型和原理高效液相色谱法的固定相和流动相及其选择高效液相色谱仪高效液相色谱分析方法 Introduction 3 对流动相的要求 不与固定相发生化学反应 对样品有适宜的溶解度 必须与检测器相适宜 粘度小 2 化学键合相色谱法的流动相 4 n1 2 1k2R 4 1 k2n 由固定相及色谱柱填充质量决定 主要受溶剂种类的影响k 主要受溶剂配比的影响 1 溶剂系统对分离度的影响 5 2 溶剂的强度和选择性 a 溶剂的极性和强度 正相分配色谱 流动相极性小于固定相极性 极性小的先流出 适于极性组分分离 反相分配色谱 流动相极性大于固定相极性 极性大的先流出 适于非极性组分分离 6 7 b 选择流动相时应注意的几个问题 1 尽量使用高纯度试剂作流动相 防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加 2 避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子 如使固定液溶解流失 3 试样在流动相中应有适宜的溶解度 防止产生沉淀并在柱中沉积 4 流动相同时还应满足检测器的要求 当使用紫外检测器时 流动相不应有紫外吸收 8 GC 填充柱 H A B u Cu毛细管柱 H B u CuHPLC H A Cu 3 分离条件的选择 1 HPLC中的速率理论 9 A 2 dpA减小的措施 降低dp 3 5 m降低 球形 仄粒度分布固定相高压 匀浆装柱 a 涡流扩散 eddydiffusion 10 B 2 DmDm T 液 气THPLC为室温u最佳 3 5倍 B u可忽略不计 b 纵向扩散 longitudinaldiffusion 11 C Cm Csm CsCs 化学键合相 单分子层 C Cm CsmHPLC H A Cmu Csmu c 传质阻抗 masstransferresistance 12 13 14 流动相流速提高 色谱柱柱效降低 变化不如在GC中快 一般流量为1ml min 15 HPLC的适宜条件 固定相与装柱 小粒度 均匀的球形键合相 匀浆法装柱 流动相 低粘度 低流量 甲醇 1ml min 柱温 25 C 16 2 分离条件的选择 a 正相键合相色谱法的分离条件 一般以极性键合相为固定相 如氰基 分离含双键的化合物 氨基键合相 分离多基团化合物如甾体 强心苷以及糖类 等流动相通常采用烷烃加适量极性调节剂 17 b 反相键合相色谱法的分离条件 一般以非极性键合相和固定相最常用ODS C18 短链烷基键合相用于极性化合物的分离 苯基键合相适用于分离芳香化合物以及多羟基化合物 如黄酮苷类 流动相一般以极性最强的水为基础溶剂 加入甲醇 乙腈等极性调节剂可选择弱酸 醋酸 弱碱 氨水 或缓冲盐 磷酸盐 醋酸盐 调节pH 抑制组分理解 增强保留调节流动相的离子强度也可改善分离效果 18 c 反相离子对色谱法的分离条件 C8或C18键合相为固定相离子对试剂的选择酸类或带负电荷的物质 常用季铵盐分析碱类或带正电荷的物质 常用烷基磺酸盐离子对试剂浓度一般在3 10mmol L流动相pH的选择调节pH使试样组分与离子对试剂全部离子化 19 4 分离类型选择 20 三 高效液相色谱仪 21 流程 动画 22 1 输液系统 1 高压输液泵主要部件之一 压力 150 350 105Pa 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相 10 m 液体的流动相高速通过时 将产生很高的压力 因此高压 高速是高效液相色谱的特点之一 应具有压力平稳 脉冲小 流量稳定可调 耐腐蚀等特性 23 洗脱方式 等强度洗脱 isocraticelution在一个分析周期内流动相组成保持恒定 梯度洗脱 gradientelution在一个分析周期内 按一定程序不断改变流动相的组成 如溶剂的极性 离子强度和pH等 2 梯度淋洗装置 24 高压梯度 利用两台高压输液泵 将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室 混合后进入色谱柱 低压梯度 一台高压泵 通过比例调节阀 将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合 25 1 进样器 六通进样阀 流路中为高压力工作状态 通常使用耐高压的六通阀进样装置 其结构如图所示 2 分离和进样系统 26 2 高效分离柱 柱体为直型不锈钢管 内径1 6mm 柱长5 40cm 发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效 27 3 检测系统 专属型检测器只能检测某些组分的某一性质紫外检测器 荧光检测器通用型检测器检测一般物质均具有的性质示差折光检测器 蒸发光散射检测器 28 灵敏度高噪音低线性范围宽重复性好适用范围广 29 应用最广 对大部分有机化合物有响应 特点 灵敏度高 线形范围高 流通池可做的很小 容积8 L 对流动相的流速和温度变化不敏感 波长可选 易于操作 可用于梯度洗脱 紫外检测器ultravioletdetector UVD 30 a 可变波长检测器 31 b 光电二极管阵列检测器photodiodearraydetector PDAD 紫外检测器的重要进展 光电二极管阵列检测器 1024个二极管阵列 各检测特定波长 计算机快速处理 三维立体谱图 如图所示 32 光电二极管阵列检测器 33 工作原理化合物受紫外光激发后 发射出比激发光波长更长的荧光 荧光强度 F 与激发光强度 I0 及荧光物质浓度 c 之间的关系为 Q 量子产率K 荧光收集效率 摩尔吸光系数l 光径长度 2 荧光检测器fluorophotometricdetector FD 34 特点 灵敏度高 高于紫外检测器 只适用于能产生荧光或其衍生物能发荧光的物质 是体内药物分析常用的检测器之一 35 3 安培检测器amperometricdetector 工作原理在电极间施加一恒定电位 当电活性组分经过电极表面时 发生氧化还原反应 产生电量 Q 的大小符合法拉第定律 Q nFN 因此反应的电流 I 为 n 每摩尔物质在氧化还原过程中转移的电子数F 法拉第常数N 物质的摩尔数t 时间 36 4 蒸发光散色检测器evaporativelightscatteringdetector ELSD 流动相 样品 加热 流动相蒸发除去 组分形成气溶胶 强光 测定散射光强I kmb 37 特点 通用型 如糖类 氨基酸等分析适用于挥发性低于流动相的组分灵敏度低流动相必须是挥发的 不能含有缓冲盐 38 组分 发光试剂 激发态产物 光辐射 基态 特点 灵敏度高选择性高不需光源 5 化学发光检测器 39 四 高效液相色谱分析方法 40 色谱鉴定法化学鉴定法两谱联用鉴定法 1 定性方法 色谱系统适用性内容 塔板数 分离度 拖尾因子和重复