生物化学实验二--教学课件ppt.ppt

生物化学实验 二 绪论 随着生物化学的发展和生物化学教学内容的不断丰富 生物化学实验也在不断更新和提高 本门课程在以往教学工作的基础上 结合生物化学实验教学 力求使学生能够更加深刻地学习生物化学课程 本实验课实验项目覆盖了当今生物化学研究中常用的技术和方法 绪论 一 实验目的掌握蛋白质 酶 核酸 糖等重要物质的分离 纯化和测定技术的原理及方法 掌握生物化学的基本知识 基本理论及基本实验技能 培养分析和解决问题能力以及严谨细致的科学作风 创新能力等综合素质 绪论 二 通过生物化学实验应该做到学习设计一个实验的基本思路 掌握各个实验的基本原理 学会严密地组织自己的实验 合理地安排实验步骤和时间 训练实验的动手能力 学会熟练地使用各种生物化学实验仪器 学会准确翔实地记录实验现象和数据的技能 提高实验报告的写作能力 能够整齐清洁地进行所有的实验 掌握生物化学的各种基本实验方法和实验技术 尤其是各种电泳技术和层析枝术 为今后参加科研工作打下坚实的基础 绪论 三 实验室规则 自觉遵守学习纪律 保持实验室肃静 不得喧哗吵闹 迟到早退 爱护仪器 厉行节约 试剂 药品 蒸馏水等应节约使用 不得浪费 如不慎损坏仪器 应及时报告老师 说明原因 贵重 精密仪器 应先熟悉使用方法 在老师的指导下 严格按操作规程操作 发现故障 应立即报告老师 不得擅自处理 仪器使用完毕后 一定要填写使用记录 绪论 取用试剂时 应仔细辨明标签 以免取错 取完试剂后 应及时将瓶盖盖好 放回原处 切忌乱拿乱放 注意安全 对于有毒 腐蚀的试剂应避免其直接接触人体及衣物 乙醚 丙酮等易燃试剂应远离火源 以免发生意外 注意实验室卫生 整洁 废弃液体应倒入水槽 实验用过的和棉花 废纸 沉淀废渣及其他废弃物品等均应放入指定容器 不得随意乱扔 实验结束后应将实验台整理好 并清扫 整理实验室 关好水 电 门 窗 方可离开实验室 绪论 四 实验须知 实验前应作好预习 认真阅读实验指导 明确学习目标 能简述实验内容及主要的操作步骤 实验过程中 应根据实验指导及老师的要求 认真操作 细心观察 如实记录 严禁捏造实验数据 提倡实事求是的科学态度 杜绝弄虚作假 实验结束后 将实验原始数据填写到实验报告册中的原始数据栏 并当场交给老师批阅 回去后要认真书写实验报告 及时交老师批阅 绪论 五实验记录与实验报告 1 实验记录实验前写好实验预习报告 钢笔和园珠笔 实验中应及时准确地记录所观察到的现象和测量的数据 直接填写到实验报告册的原始数据栏 实验记录要注意有效数字 如吸光度值应为 0 050 而不能记成 0 05 所有数据都应如实记录 不得随意涂改 实验中要详细记录实验条件 如使用的仪器型号 编号 生产厂等 生物材料的来源 试剂的规格 试剂的浓度等 杜绝一切抄袭和弄虚作假现象 一旦发现后果自负 绪论 五实验记录与实验报告 2 实验报告实验预习报告包括如下内容 实验项目名称 详细实验目的 原理 实验操作步骤 注意事项 实验报告包括如下内容 实验项目名称 简写实验目的 原理 实验结果 分析与讨论 注意事项等 实验一激活剂和抑制剂对酶活力的影响 一 目的了解激活剂和抑制剂以及pH值对酶活力的影响 掌握淀粉酶活性鉴定的方法 实验一激活剂和抑制剂对酶活力的影响 二 原理 一 酶活力与环境pH值有密切关系 通常各种酶只有在一定pH范围内才有活力 酶活力最高时的pH称为该酶的最适pH 低于或高于该pH 酶的活力逐渐降低 本实验通过磷酸氢二钠和磷酸二氢钠的不同配比调制出不同的pH 将淀粉与酶相混 淀粉被水解 遇碘不显蓝色 酶活力强 需时短 说明该环境pH是酶比较适应的 反之 则说明环境pH是酶不太适应的 根据试液颜色褪去时间的长短 推断出试验酶的最适pH 实验一激活剂和抑制剂对酶活力的影响 二 原理 二 酶的活性受某些物质的影响 有些物质能增加酶的活性 称为激活剂 而另一些物质则降低酶的活性 称为抑制剂 Cl 是唾液淀粉酶的激活剂 而为抑制剂 将淀粉与酶相混 作用一段时间后 淀粉被水解 遇碘不显蓝色 酶活力强 需时短 酶活力弱 需时长 故可用反应时间表示酶活力的强弱 Cu2 实验一激活剂和抑制剂对酶活力的影响 四 实验器材1 0 2mol L的Na2HPO42 0 2mol L的NaH2PO43 1 淀粉液 称取可溶性淀粉1g 先用少量水加热调成糊状 再加热水稀释至100ml 4 1 的氯化钠溶液 1gNaCl溶于100ml蒸馏水5 1 硫酸铜溶液 1gCuSo4溶于100ml蒸馏水6 稀碘液 于2 碘化钾溶液中加入碘至淡黄色 实验一激活剂和抑制剂对酶活力的影响 五 操作取干净试管5只 表1 见书167页 加入试液 加入酶后 迅速混匀 置37 水浴保温 每隔1min从3号管中去溶液2滴加到已有碘化钾 碘试剂的白磁盘中 观察颜色变化你 直至碘不显色时 再向各管加碘化钾 碘试剂2滴 摇匀后观察 根据实验结果找出唾液淀粉酶的最适pH 实验一激活剂和抑制剂对酶活力的影响 五 操作取试管3支 按表2编号并加入试剂 加毕 摇匀 同时置40 水浴保温 每隔2min取液体1滴置白瓷板上用碘液试之 哪支管液最先不呈现蓝色 哪支管次之 说明原因 管号 试剂 实验一激活剂和抑制剂对酶活力的影响 六 实验注意事项1 实验过程中试剂取量一定要保证一致性 同时一定要认真观察实验现象 不能漏过实验颜色的变化点 2 要正确找到反应终点 并记下相应反应时间 3 要在预热2min后加入唾液 并在加入唾液后马上记时 实验一激活剂和抑制剂对酶活力的影响 六 实验注意事项5 实验中一定要保留一份没有加入酶液的空白对照 以便于比对颜色变化6 各管试剂加入后 一定要迅速充分混匀再进行试验检测 实验二 可溶性糖的薄层层析分离与定量鉴定 一 目的和要求1 了解并初步掌握吸附层析的原理 2 学习薄层层析的一般操作及定性与定量鉴定的方法 3 学习提取植物材料中可溶性糖的一般方法 并学会简易薄板的制作 实验二 可溶性糖的薄层层析分离与定量鉴定 二 原理1 植物组织中的可溶性糖可用一定浓度的乙醇提取出来 经除去杂质 即可获得较纯的可溶性糖混合物 实验二 可溶性糖的薄层层析分离与定量鉴定 二 原理2 薄层层析是层析法的一种 层析法是利用被分离样品混合物中各组分的物理 化学差别 使各组分以不同程度分布在两个 相 中 这两个相通常使一个被固定在一定的支持物上的 称为固定相 另一个是移动的 称为流动相 当流动相流过固定相时 在移动过程中由于各组分在两相中的分配情况不同 或吸附性质不同 或电荷分布不同 或离子亲和力不同等 而以不同速度前进 从而达到分离的目的 实验二 可溶性糖的薄层层析分离与定量鉴定 二 原理3 薄层层析是一种快速而微量的层析方法 它是将一种固定支持物均匀地涂在薄板上 对物质进行层析的方法 本实验只讨论吸附薄层层析 即所有支持物是吸附剂 如硅胶粉 层析时 主要是根据吸附剂对样品中各组分的吸附能力不同 因此个组分的移动速度不同 从而达到分离混合物的目的 实验二 可溶性糖的薄层层析分离与定量鉴定 二 原理4 糖为多羟基化合物 具有较强的极性 在硅胶G薄板上展层时 糖与硅胶分子有一定的吸附力 硅胶分子与糖的吸附能力大小取决于糖的分子量和羟基数目 造成各种糖分子在展层过程中移动的距离不同 从而将各种糖分离出来 一般吸附力的大小为 三糖 双糖 己糖 戊糖 其中各种糖移动的速率可用Rf值表示 通过与标准糖的Rf值比较 即可鉴定出植物组织提取液中糖的种类 实验二 可溶性糖的薄层层析分离与定量鉴定 二 原理5 Rf计算公式 溶质斑点中心到样点的距离Rf 值 溶剂前沿到点样点的距离 实验二 可溶性糖的薄层层析分离与定量鉴定 三 实验材料 仪器和试剂1 材料 苹果或其他植物材料2 仪器 1 离心机及离心管 2 天平 3 研钵 4 量筒25ml 5 移液管10ml 6 恒温水浴 7 毛细管 8 层析缸 9 吹风机 10 玻璃板 7 15cm 11 烘箱 12 喷雾器 13 烧杯50ml 100ml铅笔 尺子 实验二 可溶性糖的薄层层析分离与定量鉴定 三 实验材料 仪器和试剂3 试剂 1 无水酒精 2 氯仿 冰醋酸 水 配比为30 35 5 3 1 标准糖溶液 10mg ml 木糖 葡萄糖 果糖 蔗糖等 4 苯胺 二苯胺 磷酸显色剂 2克二苯胺 加2ml苯胺 10ml85 磷酸 1ml浓HCl 100ml丙酮 溶后摇匀 5 0 1M硼酸溶液 实验二 可溶性糖的薄层层析分离与定量鉴定 四 操作1 水果中可溶性糖提取液的制备1 1取洗净的苹果 或其他水果 削去果皮 称8g果肉在研钵中研成匀浆后 倒在四层洗净的纱布上 包起置于漏斗 用干净玻璃棒将果汁压出 1 2取果汁2ml于离心管中 加无水乙醇6ml 充分混匀后 在3000转 分下离心20分钟 上清夜即为可溶性糖提取液 实验二 可溶性糖的薄层层析分离与定量鉴定 四 操作2 苹果提取液中可溶性糖的分离鉴定2 1点样取活化后的硅胶G板一块 距底边1 5厘米水平线上确定4个点 相互间隔1厘米 其中3个点 分别点上5 的木糖 葡萄糖 蔗糖标准溶液数滴 另一点点上苹果提取液数滴 一般点4次 2 2展层以氯仿 冰醋酸 水展层剂上行展层 当展层前沿达距薄板顶端1 0厘米左右处 取出玻板用吹风机吹干 2 3染色以苯胺 二苯胺 磷酸显色剂喷雾 于85 烘箱中10分钟 各种糖即显示出不同色斑与标准糖比较 观察各点的颜色 2 4计算根据斑点颜色及Rf值即可初步鉴定出苹果提取液中所存在的可溶性糖的种类 实验二 可溶性糖的薄层层析分离与定量鉴定 四 操作3 板的制备 3 1玻璃板须表面平整 光滑 清洁 用洗涤液浸泡 洗净 晾干 否则吸附剂容易剥落 3 2取硅胶G粉2克 加0 1M硼酸溶液4 5ml于研钵中充分研磨成糊状时 倾倒在薄板上 然后用手轻轻倾斜玻璃板 使糊状吸附剂在整块板上分布均匀 表面平坦光滑 3 3将制好的薄板置于水平台上自然晾干后 用前于110 烘箱中活化一小时使用 实验二 可溶性糖的薄层层析分离与定量鉴定 五 实验注意事项1 薄板制备过程中 一定要保证玻璃板干净 干燥且无油渍2 薄板制备过程中 加硼酸搅拌及研磨一定要快 要研磨均匀 一般研磨到发出如脂肪光泽时 且要有一定的流动性 立即涂匀为最好3 铺好板后 要在水平台上自然晾干 用前于110 烘箱中活化一小时 时间计算从达110 开始 但活化时要在低温 60 左右 时就将板放进烘箱 防止因骤然升温导致硅胶板脱落 实验二 可溶性糖的薄层层析分离与定量鉴定 五 实验注意事项4 在用毛细管点样时 毛细管应垂直于硅胶G板的方向点样 而且毛细管接触G板的时间应尽量短 点样斑点直径一般不宜超过3mm 5 在确定点样位置时 只需在板上轻轻一点 决不能点得过深 且不能用油笔或钢笔点 样点位置一定要高于展层剂层面 6 点样时 要等前一次的样点干燥后 再点下一次 一般每个样点点4次 实验二 可溶性糖的薄层层析分离与定量鉴定 五 实验注意事项7 在进行展层前 要先在层析缸中加入一些层析剂 使整个缸内充满层析剂 以使样品能在一个稳定的环境中进行展层 8 在展层好后 立即用尺量出溶剂前沿距离 不要等到吹干后再量 9 在用吹风机吹干时要注意用小风吹 或者将吹风机离板较远点吹 实验二 可溶性糖的薄层层析分离与定量鉴定 五 实验注意事项10 染色完成后 放置于烘箱85 烘时 若烘了10min后有些点还是不显色 可以在记录已显色点的颜色和距离后 继续烘 直至显色为止 11 为了使实验现象明显 提取糖时 宜使糖的浓度高一些 实验三离子交换柱层析分离氨基酸 一 目的通过实验要求学会装柱 洗脱 收集等离子交换层析技术 实验三离子交换柱层析分离氨基酸 二 原理树脂 惰性支持物 结合了阳离子或阴离子后 可与阳离子或阴离子结合 改变溶液的离子强度则这种离子结合又解离 由于不同的氨基酸在不同的pH值及离子强度溶液中所带的电荷各不相同 故对离子交换树脂的亲和力也各不相同 对阳离子树脂而言 氨基酸的pI值越高 对阳离子交换树脂的亲和力越强 洗脱速度越慢 从而可以在洗脱过程中按先后顺序洗出 达到分离的目的 实验三离子交换柱层析分离氨基酸 三 实验器材1 层析柱 带加压装置 2 刻度试管 试管架 10ml以上15支3 烧杯250ml1支4 吸管1 0ml和5 0ml 实验三离子交换柱层析分离氨基酸 四 实验试剂1 732型阳离子树脂2 柠檬酸缓冲液 0 45mol L pH5 3 3 显色剂 0 5 茚三酮 4 0 1CuSO4溶液5 氨基酸样品 0 005mol L的Asp和Lys 用0 02mol LHCl配制 实验三离子交换柱层析分离氨基酸 五 操作1 树脂预处理干树脂经蒸馏水膨胀 倾去小颗粒 然后用4倍体积的2mol L的HCl及2mol L的NaOH依次浸洗 每次浸2h 并分别用蒸馏水洗至中性 在用1mol L的NaOH浸半小时 转型 用蒸馏水洗至中性 实验三离子交换柱层析分离氨基酸 五 操作2 装柱 湿装法 垂直装好层析柱 关闭出口 在柱子底部加一棉花团 加入柠檬酸缓冲液约1cm高 将处理好的树脂加等体积缓冲液 搅匀 沿管内壁缓慢加入 柱底沉积约1cm高时 缓慢打开出口 继续加入树脂 直至8cm高 小柱可装至12cm 装柱要求连续 均匀 无纹格 无气泡 表面平整 液面不得低于树脂表面 否则要重新装柱 实验三离子交换柱层析分离氨基酸 五 操作3 平衡将3倍柱床体积 约50ml 的缓冲液按1ml min的速度进行平衡 直至树脂表面约1 5mm高液面时 关闭旋纽 4 上样 加样 沿管壁接近液面处加入0 5ml样品 慢慢打开出口 使液面降至与树脂表面相平时关闭旋纽 吸少量缓冲液冲洗柱内壁数次 加缓冲液至4cm高 5 洗脱 接上步骤打开旋纽 以柠檬酸缓冲液洗脱 洗脱流速 0 5ml min 用试管架上的试管依次接收 每管接收5ml 接15管 实验三离子交换柱层析分离氨基酸 五 操作6 测定分别取各管洗脱液1ml 各加入显色剂1ml 混合后沸水浴5min 冷却 各加0 1 CuSO4溶液3ml 混匀 测A570nm 以A值为纵坐标洗脱液累计体积 5ml为一个单位 为横坐标绘制洗脱曲线 实验三离子交换柱层析分离氨基酸 六 实验注意事项1 树脂预处理要严格操作 特别是转型一定要充分 2 装柱前在柱子底部加一棉花球 3 装柱时 边加树脂边用木质棒 或橡胶棒 轻敲柱子 使基质缓缓下沉 4 装柱要求连续 均匀 无纹格 无气泡 表面平整 整个层析过程中液面一定不得低于树脂表面 5 要注意及时开启和关闭旋纽 6 要注意控制流速 不宜过快 7 在加入好样品后 在洗壁前 就要接收洗脱液 8 测定A值时 一定要用空比色杯调吸光度零点 实验四维生素C的定量测定 2020 3 16 43 可编辑 一 实验目的 掌握Vc提取和定量方法学会计算Vc的含量 二 实验原理 1 维生素C是人类营养中最重要的维生素之一 缺乏时会产生坏血病 因此又称为抗坏血酸 维生素C具有很强的还原性 2 在碱性溶液中加热并有氧化剂存在时 抗坏血酸易被氧化而破坏 在中性和微酸性环境中 抗坏血酸能将染料2 6 二氯酚靛酚还原成无色的还原型2 6 二氯酚靛酚 同时将抗坏血酸氧化成脱氢抗坏血酸 氧化型的2 6 二氯酚靛酚在酸性溶液中呈红色 在中性或碱性溶液中呈蓝色 因此 当用2 6 二氯酚靛酚滴定含有抗坏血酸的酸性溶液时 在抗坏血酸尚未全部被氧化时 滴下的2 6 二氯酚靛酚立即被还原成无色 但溶液中的抗坏血酸一旦被氧化完时 则滴下的2 6 二氯酚靛酚立即使溶液呈现红色 所以 当溶液从无色转变成微红色时 即表示溶液中的抗坏血酸刚刚全部被氧化 此时即为滴定终点 从滴定标淮溶液时2 6 二氯酚靛酚的消耗量 可以计算出被检物质中抗坏血酸的含量 实验原理如下图 该法简便易行 但有下列缺点 在生物组织内和组织提取物内 抗坏血酸还能以脱氢抗坏血酸及结合抗坏血酸的形式存在 它们同样地具有维生素C的生理作用 但不能将2 6 二氯酚靛酚还原脱色 生物组织提取物和生物体液中常合有其他还原性物质 其中有些也可在同样实验条件下使2 6 二氯酚靛酚还原脱色 在生物组织提取物中 常有色素类物质存在 给滴定终点的观察造成困难 三 实验器材 1 猕猴桃100g2 吸管1 0ml 10 0ml3 容量瓶1000ml4 电子分析天平5 研钵6 漏斗 四 实验试剂 2 草酸溶液 草酸2g溶于100ml蒸馏水中1 草酸溶液 溶1g草酸于100ml蒸馏水中标准抗坏血酸溶液 0 1mg ml 准确称取50 0mg纯抗坏血酸 溶于1 草酸溶液 并稀释至500ml 贮于棕色瓶中 冷藏 最好临用时配置 0 1 2 6 二氯酚靛酚溶液 溶500mg2 6 二氯酚靛酚于300ml含有104mlNaHCO3的热水中 冷却后加水稀释至500ml 滤去不溶物贮棕色瓶内 冷藏 五 实验操作 1 样液制备称取100克猕猴桃 放入研钵中 加入适量2 草酸研磨成匀浆 将匀浆转入1000ml容量瓶 用草酸定容至1000ml 并混匀 抽滤 滤液备用 研磨时为什么要加2 的草酸 2 的草酸抑制抗坏血酸氧化酶 防止抗坏血酸被氧化 为2 6 二氯酚靛酚显色提供酸性环境 2 滴定 使用酸式还是碱式滴定管 1 标准液滴定准确吸取标准抗坏血酸溶液1 0ml 含0 1mg抗坏血酸 置100ml锥形瓶中 加9ml1 的草酸 滴定管以0 1 的2 6 二氯酚靛酚滴定至淡红色 并保持15s即为终点 由所用染料的体积 V 计算出1ml染料相当于多少mg抗坏血酸 2 样液滴定准确吸取滤液两份 每份10 0ml分别放入两个100ml锥形瓶内 滴定方法同前 六 计算 m VT m0 100m 100g样品中含抗坏血酸的质量 mg V 滴定时所用去染料体积数 ml T 每毫升染料能氧化抗坏血酸质量数 mg ml m0 10ml样液相当于含样品之质量 g 七 实验 注意事项 1 过滤提取滤液时 若浆状物不易过滤 可离心取上清液测定 2 标准抗坏血酸溶液应贮于棕色瓶中冷藏 最好临用时配制3 滴定过程一般不超过两分钟 但滴定时要逐滴加入4 样品中某些杂质亦能还原2 6 二氯酚靛酚 但速度较抗坏血酸慢 故终点以淡红色存在15s内为准5 滴定管使用前要检漏 并用滴定液润洗滴定管 同时要排去其中的气泡6 滴定过程中若不慎有滴定液粘在壁上 可以用少量2 的草酸洗到瓶中去 实验五DNA琼脂糖凝胶电泳 一 实验目的学习并掌握电泳的基本原理和操作 通过DNA琼脂糖凝胶电泳了解DNA的纯度 含量和相对分子质量 附 DNA琼脂糖凝胶电泳与聚丙烯酰胺凝胶电泳应用区分 聚丙烯酰胺凝胶电泳 普遍用于分离蛋白质及较小分子的核酸 琼脂糖凝胶孔径较大适用于分离同工酶及其亚型 大分子核酸等 应用较广 实验五DNA琼脂糖凝胶电泳 二 实验原理琼脂糖凝胶电泳是重组DNA研究中常用的技术 可用于分离 鉴定和纯化DNA片段 不同大小 不同形状和不同构象的DNA分子在相同的电泳条件下 如凝胶浓度 电流 电压 缓冲液等 有不同的迁移率 所以可通过电泳使其分离 DNA分子在琼脂糖凝胶电泳中有电荷效应和分子筛效应 前者由分子所带电荷量决定 后者与分子大小和构象有关 当溶液pH PI时 分子带负电荷 在电场中向正级移动 实验五DNA琼脂糖凝胶电泳 在一定电场强度下 DNA的移动速率与其分子量的对数成反比 另外还有V闭环 V线性 V开环 凝胶中的DNA可与荧光染料溴化乙锭 EB 结合 在凝胶成像系统中进行观察 籍此可分析实验结果 实验五DNA琼脂糖凝胶电泳 三 仪器与器材1 水平电泳仪2 水平式核酸电泳槽3 凝胶成像系统4 移液枪5 一次性手套6 微波炉7 紫外检测仪 实验五DNA琼脂糖凝胶电泳 四 试剂与材料 1 琼脂糖2 6 点样缓冲液 0 2 溴酚蓝 约0 3Kb 50 蔗糖3 DNA标准品 分子量约0 5Kb 4 50 TAE电泳缓冲液贮存液配方 每升含Tris242g 冰醋酸57 1mL0 5mol EDTA100mL pH8 0 使用时稀释成1 TAE 5 0 8 琼脂糖 0 8g琼脂糖用100mL1 TAE微波溶解 6 10mg mLEB溶液 溴乙锭1 0g加蒸馏水100mL配置 实际操作是在蒸馏水中加几滴EB溶液至溶液呈为红色即可 实验五DNA琼脂糖凝胶电泳 五 操作步骤 1 将凝胶成形模具水平放置 并用胶条封好 将选好的梳子放好 梳子底部与模具之间留1mm空间 2 每组称取DNA电泳用琼脂糖0 16g 可三组共用0 48克 放入250ml的三角烧瓶中 加入20mL 三组用60mL 1 TAE缓冲液 混匀后 将烧瓶置于微波炉中 加热煮沸 直至琼脂糖完全溶解 3 关闭微波炉 取出三角烧瓶 将其置室温下冷却至50 左右 手握烧瓶可以耐受 不在凝胶溶液中加入溴化乙锭 采取电泳完成后统一染色 混匀后 即将凝胶溶液倒入胶板铺板 实验五DNA琼脂糖凝胶电泳 五 操作步骤 4 室温下待凝胶完全凝固 需时约30分钟 揭去胶条 拔出梳齿 将胶板放入电泳槽中 5 在电泳槽加入1 TAE缓冲液 以高出凝胶表面2mm为宜 6 用加样器吸取与点样缓冲液混匀的样品3 L 加入到点样孔中 注意加样器吸头应恰好置于凝胶点样孔中 不可刺穿凝胶 也要防止将样品溢出孔外 7 接通电源 调节电压至50伏 电泳40分钟左右后 将凝胶板取出 放置于EB溶液中染色约15分钟在凝胶成像系统中观察结果 包括DNA样品 Marker的描出结果图 并算出各自的迁移率 迁移率 点样孔到样点的距离 点样孔到胶带末端距离 实验五DNA琼脂糖凝胶电泳 六实验注意事项1 注意正确使用移液枪 注意取液和放液时压手柄的位置区别 注意不要吸入气体 2 每厘米电压不超过5V 若电压过高分辨率会降低 只有在低电压时 线性DNA分子的电泳迁移率与所用电压成正比 若是一台电泳仪接两个电泳槽 则宜调成8V cm 3 正确将电泳仪与电泳槽连接 即 接 接 4 溴乙锭为一种有毒试剂 使用时一定要戴手套操作 注意防护 实验五DNA琼脂糖凝胶电泳 六实验注意事项5 样品电泳是从 向 方向移动 6 用移液枪吸取样品时 注意要在进入溶液前压下手柄 并在溶液中吸取好后取出 在推出样液时 一定要推到底且一直摁住直到枪头到液面以上 7 注意加样器吸头应恰好置于凝胶点样孔中 不可刺穿凝胶 也要防止将样品溢出孔外 8 染色前一定要在胶的正极端左下角切一小块 以备染色完成后进行定位 实验五DNA琼脂糖凝胶电泳 作业 观察实验现象 描出电泳图 算出迁移率 实验六动物肝脏中DNA的提取 一 目的1 掌握DNA分离纯化的原理和方法2 熟悉台式离心机的使用3 掌握DNA定量技术 实验六动物肝脏中DNA的提取 二 实验原理1 核蛋白抽提 1 细胞内的核酸多以核蛋白的形式存在 这两类核蛋白 核酸与脱氧核酸蛋白 在0 14mol L氯化钠溶液中的溶解度相差很大 RNA核蛋白在此溶液中具有很高的溶解度 DNA核蛋白的溶解度却相当低 而能溶于水和高浓度盐中 2 制成肝匀浆后 用0 14mol L氯化钠溶液抽提 可将两种核蛋白分离 分离过程中加入少量柠檬酸钠 可抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的水解作用 实验六动物肝脏中DNA的提取 二 实验原理2 DNA制备 1 SDS 十二烷基硫酸钠 能使DNA核蛋白产生解聚作用 在含有脱氧核糖核蛋白的溶液中加入SDS DNA即与蛋白质分离开 2 用氯仿将蛋白质沉淀除去 而DNA溶解于水相 最后用冷乙醇将DNA析出 而获得纯化的DNA 3 在氯仿中加入少量异戊醇能减少操作过程泡沫的产生 并有助于分相 使离心后的上层水相 中层变性蛋白 下层有机溶剂相维持稳定 实验六动物肝脏中DNA的提取 二 实验原理3 DNA纯度测定 不操作 DNA和RNA在波长260nm处有很高的吸收峰值 蛋白质则在280nm处有很高的吸收峰值 利用这个原理 我们测定纯化样品在260nm和280nm处的吸光度 可以推算出样品中DNA的浓度 并判断其纯度 纯净的DNA样品A260 A280的比值约为1 8 样品中含有蛋白质或其它杂质 会使A260 A280的比值下降 A260 A280的比值大于1 6基本能达到各种后继实验的要求 实验六动物肝脏中DNA的提取 三 实验材料1 仪器 玻璃匀浆器离心机试管刻度吸管UV2450紫外可见分光光度计2 试剂 1 0 1mol L氯化钠 0 05mol L柠檬酸钠溶液 pH6 8 2 氯化钠固体 A R 3 0 15mol L氯化钠溶液 含0 0015mol L柠檬酸钠 称取氯化钠0 828g和柠檬酸钠 2H2O0 341g 用蒸馏水溶解并稀释至1000m1 4 95 乙醇溶液 冷藏 5 5 十二烷基硫酸钠 SDS 溶液 5gSDS溶于100ml水中称取25克SDS溶于500m145 乙醇 6 氯仿 异戊醇混合液 氯仿 异戊醇 20 1 实验六动物肝脏中DNA的提取 四 实验操作1 肝匀浆制备 新鲜猪肝 用0 9 NaCl洗去血液 称取8g肝组织 加16ml0 1mol LNaCl 0 05mol L柠檬酸钠溶液 充分研磨 冰浴 制成肝匀浆 2 匀浆物在4000r min下离心10min 弃上相 得沉淀 沉淀中再加入25ml缓冲液 在4000r min下离心20min 得沉淀 实验六动物肝脏中DNA的提取 四 实验操作3 在上述沉淀中加入40ml0 1mol LNaCl 0 0015mol L柠檬酸钠缓冲液 21ml氯仿 异戊醇混合液 4ml5 SDS使其终浓度为0 41 振摇30min 然后缓慢加固体NaCl3 6克 使其终浓度为1mol L 将上述混合液在3500r min离心20min 离心后溶液分三层 上层液为水相 含DNA 中层为蛋白质沉淀 下层为有机相 吸取上层液倒于另一试管中 得上相 实验六动物肝脏中DNA的提取 4 在上述上相 水相 溶液中加入等体积的95 冷乙醇 边加边用玻棒慢慢搅动 将缠绕在玻棒上的凝胶状物在空气中风干 即得DNA粗品5 观察DNA颜色与状态 并在风干后称重量 并计算粗品DNA得率 实验六动物肝脏中DNA的提取 五 注意事项1 在制备肝匀浆时 应尽量在冰冷条件下进行 并尽快加入含0 0lmol L柠檬酸钠的0 14mol L氯化钠溶液 以抑制脱氧核糖核酸酶 防止DNA的分解以提高核酸得率 2 各步骤操作应力求准确 尽量减少中途核酸的丢失 保证定量测定的准确性 3 在进行匀浆液摇匀时 若是盖上盖摇 则一定要用手扣住离心管盖 同时在摇了5min左右后 打开盖子 防止出现盖子被冲出来 实验六动物肝脏中DNA的提取 五 注意事项4 实验当中有几次弃上清液和沉淀 一定要注意 第一次 第二次离