新型可吸收生物玻璃注射体在骨质疏松椎体内支撑及诱导成骨的机制.doc

www.CRTER.org隆海滨，等. 新型可吸收生物玻璃注射体在骨质疏松椎体内支撑及诱导成骨的机制新型可吸收生物玻璃注射体在骨质疏松椎体内支撑及诱导成骨的机制隆海滨1，胡营营2，孙桂森1(东营市胜利油田中心医院，1脊柱外科，2病理科，山东省东营市 257034)引用本文：隆海滨，胡营营，孙桂森. 新型可吸收生物玻璃注射体在骨质疏松椎体内支撑及诱导成骨的机制J.中国组织工程研究，2016，20(12):1690-1696.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.12.003 ORCID: 0000-0001-8560-6308(胡营营)文章快速阅读：新型可吸收生物玻璃注射体的体内支撑及诱导成骨隆海滨，男，1980年生，山东省东营市人，汉族，主治医师，硕士，主要从事脊柱研究。 通讯作者：胡营营，主治医师，东营市胜利油田中心医院病理科，山东省东营市 257034中图分类号:R318文献标识码:A文章编号:2095-4344(2016)12-01690-07稿件接受：2016-01-29http:/WWW.造模成功后，随机分3组，在L4椎体骨缺损处分别置入新型可吸收生物玻璃注射体、聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥、注射性磷酸钙骨水泥切除双侧卵巢，建立骨质疏松模型置入后12周，检测植入体抗压强度、降解性能、组织学成骨情况，以及血清骨形态发生蛋白2和转化生长因子水平新型可吸收生物玻璃注射体可能通过提高骨形态发生蛋白2和转化生长因子水平，增强骨质疏松椎体的支撑力，提高诱导成骨效果 文题释义：可注射型生物玻璃：其主要成分为SiO2、CaO、P2O3和Na2O，与人体骨类似，在材料界面与人体骨组织之间形成牢固化学键，连接强度提供很高的移植物与界面稳定性，传导性优于磷酸钙骨水泥、羟基磷灰石。体内实验表明，生物玻璃置入体内后，可在其HCA-胶原层内发现已完成矿化的成熟骨细胞。生物玻璃具有较好的生物相容性和生物活性，具备骨传导和骨诱导活性，能在组织与材料之间引起细胞内外的反应。新型可吸收生物玻璃注射体：生物玻璃因具有良好的生物活性和生物相容性倍受关注，将其作为可注射型材料与磷酸钙骨水泥复合形成新型可吸收生物玻璃注射体，可兼具二者优点，预计有更佳的应用空间。骨质疏松：是一种系统性骨病，其特征是骨量下降和骨的微细结构破坏，表现为骨的脆性增加，因而骨折的危险性大为增加，即使是轻微的创伤或无外伤的情况下也容易发生骨折。骨质疏松症是一种多因素所致的慢性疾病。在骨折发生之前，通常无特殊临床表现。该病女性多于男性，常见于绝经后妇女和老年人。随着中国老年人口的增加，骨质疏松症发病率处于上升趋势，在中国乃至全球都是一个值得关注的健康问题。摘要背景：生物玻璃具有良好的生物活性和生物相容性，将其与磷酸钙骨水泥复合形成新型可吸收生物玻璃注射体，可兼具二者优点，预计有更佳的应用空间。目的：探讨新型可吸收生物玻璃注射体在骨质疏松椎体内支撑及诱导成骨的机制。方法：切除27只雌性SD大鼠双侧卵巢，制作骨质疏松模型，造模后1个月将大鼠随机分为3组，均在L4椎体制作骨缺损，实验组置入新型可吸收生物玻璃注射体，对照1组置入聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥，对照2组置入注射性磷酸钙骨水泥。置入后12周，检测植入体抗压强度、降解性能、组织学成骨情况，以及血清骨形态发生蛋白2和转化生长因子水平。结果与结论：实验组抗压强度、羟基磷灰石沉积量、失重率显著高于两对照组(P 0.05)，骨小梁相对体积、厚度和数量显著大于两对照组(P 0.05)，骨形态发生蛋白2和转化生长因子水平显著高于两对照组(P 0.05)。表明新型可吸收生物玻璃注射体可能通过提高骨形态发生蛋白2和转化生长因子水平，增强骨质疏松椎体的支撑力，提高诱导成骨效果。关键词：生物材料；骨生物材料；新型可吸收生物玻璃注射体；骨质疏松；聚甲基丙烯酸甲酯；注射性磷酸钙骨水泥；力学性能；骨形态发生蛋白；转化生长因子主题词：玻璃；聚甲基丙烯酸类；骨质疏松；组织工程1691ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAHMechanism of absorbable bioglass injection for vertebral body supporting and osteogenic induction in osteoporosisLong Hai-bin1, Hu Ying-ying2, Sun Gui-sen1 (1Department of Spinal Surgery, 2Department of Pathology, Central Hospital of Shengli Oil Field, Dongying 257034, Shandong Province, China)AbstractBACKGROUND: Bioglass has good biocompatibility and biological activity, which can be combined with calcium phosphate bone cement to form an absorbable bioglass that has the advantages of both materials and is expected to have a better use of space. OBJECTIVE: To explore the mechamism of the new type of absorbable bioglass injection for vertebral body supporting and osteogenic induction in osteoporosis rats.METHODS: Twenty-seven female Sprague-Dawley rats were selected to make osteoporosis models by bilateral ovariectomy, and after 1 month, the rats were randomized into three groups. Bone defect models were established in the lumbar L4 segment of all the rats. Rats in the experimental group were subjected to absorbable bioglass injection; rats in the control group 1 underwent polymethylmethacrylate bone cement injection; and rats in the control group 2 were given injectable calcium phosphate. Twelve weeks after implantation, the compressive strength, degradation and osteogenesis of the implant materials were detected, and levels of serum bone morphogenetic protein-2 and transforming growth factor- were measured.RESULTS AND CONCLUSION: The compressive strength, hydroxyapatite deposition amount, and weight loss ratio in the experimental group were significantly higher than those in the two control groups (P 0.05); the relative volume, thickness and number of bone trabeculae in the experimental group were significantly higher than those in the control groups (P 0.05); the bone morphogenetic protein-2 and transforming growth factor- protein levels in the experimental group were significantly higher than those in the two control groups (P 0.05). These findings indicate that the new-type absorbable bioglass can greatly strengthen the vertebral body supporting and promote osteogenic effect in osteoporosis by enhancing the bone morphogenetic protein-2 and transforming growth factor- protein levels.Subject headings: Glass; Polymethacrylic Acids; Osteoporosis; Tissue EngineeringCite this article: Long HB, Hu YY, Sun GS. Mechanism of absorbable bioglass injection for vertebral body supporting and osteogenic induction in osteoporosis. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(12): 1690-1696.Long Hai-bin, Master, Attending physician, Department of Spinal Surgery, Central Hospital of Shengli Oil Field, Dongying 257034, Shandong Province, ChinaCorresponding author: Hu Ying-ying, Attending physician, Department of Pathology, Central Hospital of Shengli Oil Field, Dongying 257034, Shandong Province, China1695ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction骨质疏松的主要特征是骨量减少和骨微结构破坏，导致骨脆性增加。骨质疏松极易并发骨折、松质骨压缩及骨缺损，中国50岁以上人群中有骨质疏松患者近 7 000万，每年新发脊柱压缩骨折约181万1，临床上多表现为腰背部疼痛及病理性骨折，可分为原发性、继发性和特发性3类。目前，全世界约有2亿人患有骨质疏松症，发病率居常见疾病的第7位，并且逐年上升，严重危害着全世界20%50岁以上男性及30%50岁以上女性的健康2。在中国，由于人口基数大，在人口老龄化不断加剧和人均寿命不断增加的现状下，原发性骨质疏松及其骨质疏松性骨折已成为一个严重的社会问题而备受关注3-5。椎体成形或椎体后凸成形被认为是脊柱骨质疏松压缩骨折的主要外科治疗手段。目前手术所采用的材料聚甲基丙烯酸甲酯(polymethylmethacrylate，PMMA)具有单纯支撑、产热大、不可吸收、无骨传导及骨诱导活性等缺陷6-15。因此，寻找一种具有良好流动性、骨传导、骨诱导作用，兼具良好的力学支撑性能及一定降解率的骨修复材料，已成为骨科亟待解决的难题。磷酸钙骨水泥因其自固化，无类似PMMA的产热效应，可任意塑形，具有良好的生物相容性、骨传导性及可降解性，具有广阔的临床应用价值14-15。然而，磷酸钙骨水泥在体内降解缓慢及低力学强度等缺点限制了其在临床的应用16。另外，在一些供血不足区域及伴代谢紊乱的老年病患中，磷酸钙骨水泥的骨传导作用并不足以达到完全的骨修复效果，因此赋予磷酸钙骨水泥更高的传导性或诱导性，可进一步改善其生物学性能17-18。生物玻璃因具有良好的生物活性和生物相容性倍受关注，将其作为可注射型材料与磷酸钙骨水泥复合形成新型可吸收生物玻璃注射体，可兼具二者优点19-21，预计有更佳的应用空间；并且生物玻璃释放的Ca、P、Si 离子，在材料界面与人体骨组织之间形成牢固化学键合，此化学键合的连接强度提供了很高的移植物与界面稳定性，传导性优于羟基磷灰石22。然而，国内外研发出的生物玻璃主要为固态，置入需进行周围组织的广泛暴露，将其作为可注射型材料应用于椎体成形或椎体后凸成形及不规则骨缺损(如口腔及颅面部等处的骨缺损)的填充修复鲜见文献报道。实验试图探讨新型可吸收生物玻璃注射体在骨质疏松椎体内支撑及诱导成骨的机制。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 设计 随机对照动物实验。1.2 时间及地点 于2014年7月至2015年7月在东营市胜利油田中心医院完成。1.3 材料 新型可吸收生物玻璃注射体，为由SiO2、Na2O、CaO和P2O5等基本成分组成的硅酸盐玻璃(沃伦多科技)；聚甲基丙烯酸甲酯(苏州鸿斯利塑化有限公司)；注射性磷酸钙骨水泥(上海瑞邦生物材料)；扫描电镜(Hitachi S-4800，日本)；万能力学测试仪(CSS44loo，中国长春机械科学研究院有限公司)。 实验动物：2月龄健康雌性SD大鼠30只，由东营楚商科技有限公司提供，许可证号：SCXK(鲁)2014 0006，体质量180-220 g，适应性喂养1周后进行实验。1.4 实验方法 骨质疏松大鼠模型：制作双侧卵巢切除骨质疏松大鼠模型，具体如下：全麻成功后，腹部剃毛，碘伏消毒。下腹正中切口，逐层进入腹腔，可见肾脏下方呈粉红色、桑椹状的卵巢，一侧卵巢结扎切除，同法切除另一侧。缝合腹膜及腹肌，最后缝合皮肤。1周拆线，3个月后即认为骨质疏松造模成功。造模过程中共死亡3只大鼠，死于感染。将造模成功27只大鼠随机分成3组，实验组、对照1组与对照2组，每组9只。 材料置入手术：27只大鼠全麻成功后，下腰部剃毛，碘伏消毒，以两侧髂前上棘连线与后正中交点上下5 cm做纵行切口，逐层剥离，暴露L3-5节段，向两侧延迟，暴露椎体和椎间盘，用直径3 mm钻头垂直钻通L4节段，骨面钻孔深5 mm，建立骨隧道，于隧道内置入材料，实验组新型可吸收生物玻璃注射体，对照1组置入聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥，对照2组置入注射性磷酸钙骨水泥，轻轻压实材料至骨面，然后用骨蜡封堵。止血，冲洗，缝合伤口。手术过程均在严格无菌条件下进行，术前和术后3 d用青霉素预防感染，术后分笼饲养，自由活动与进食。1.5 主要观察指标 力学性能检测：置入12周后，取出圆柱形的植入体，竖直置于万能力学测试仪的压缩工作台中心位置上，对试样施加压应力，抗压强度=F最大/A，其中F最大为试样断裂时最大载荷，A为横截面积，测量3次，取其平均值。降解性能检测：置入12周后，取出圆柱形的植入体，称质量后，按质量体积比 0.2 g/mL 加入模拟体液(含有钙、磷离子的一种稳定溶液系统，成分与血浆成分接近)中，在 37 、100%相对湿度下浸泡28 d，每天更换模拟体液1次。试样取出，去离子水冲洗后室温下晾干，用扫描电镜观察其表面形态结构。降解率即试样质量丢失，D=(W0-Wt)/W0100%，D代表体外降解率，W0及 Wt分别是材料浸泡前及浸泡后的干质量，测量3次，取其平均值。组织学检测：置入12周后，取出圆柱形的植入体，制作切片，用硬组织切片机将包埋好的标本垂直方向连续切片3张以上，切片厚度150-200 m，然后研磨抛光至 50 m，后用 Van Gieson染色组织切片。根据国际通用公式计算骨小梁相对体积、厚度和数量5，测量3次，取其平均值。血清指标检测：置入12周后，检测血清中骨形态发生蛋白2和转化生长因子水平，骨形态发生蛋白2试剂盒由济南奥诺生物工程有限公司提供，转化生长因子试剂盒由上海基免实业有限公司提供，均以ELISA法检验，按照说明书进行操作。 C A B图1 各组植入体于模拟体液中浸泡28 d后的羟基磷灰石沉积情况(扫描电镜，500)Figure 1 Deposition of hydroxyapatite immersed in the simulated body fluid for 28 days (scanning electron microscope, 500)图注：图中A为对照1组，羟基磷灰石沉积情况较差，材料表面结构较为疏松；B为对照2组，羟基磷灰石沉积情况较对照1组好，材料表面结构较为紧实；C为实验组，羟基磷灰石沉积情况最好，材料表面结构最为紧实。1.6 统计学分析 采用SPSS 20.0软件进行统计分析，计量资料以s表示，组间比较采用方差分析，P 0.05为差异有显著性意义。2 结果 Results 2.1 实验动物数量分析 造模成功27只大鼠均进入结果分析。2.2 力学性能与降解性能检测结果 实验组力学性能显著高于两对照组(P 0.05)，对照2组力学性能显著高于对照1组(P 0.05)。浸泡模拟体液发现，实验组表面羟基磷灰石沉积量、降解性显著高于其他两组(P 0.05)，对照2组表面羟基磷灰石沉积量、降解性显著高于对照1组(P 0.05)，见表1，图1。2.3 组织学骨小梁相对体积、厚度和数量检测结果 实验组骨小梁相对体积、厚度和数量均显著大于其他两组(P 0.05)，对照2组骨小梁相对体积、厚度和数量均显著大于对照1组(P 0.05)，见表2。2.4 血清学骨形态发生蛋白2和转化生长因子水平检测结果 实验组骨形态发生蛋白2和转化生长因子水平显著高于其他两组(P 0.05)，对照2组骨形态发生蛋白2和转化生长因子水平高于对照1组(P 0.05)，见表3。表1 各组植入体力学性能与降解性能的比较 (s)Table 1 Comparison of mechanical and degradation properties of different implant materials组别压缩强度 (MPa)失重率 (%)对照1组对照2组实验组FP26.85.334.45.543.55.7a 4.3260.031.615.61.9a 4.7580.036表注：与其余两组比较，aP 0.05。表2 各组植入体骨小梁相对体积、厚度和数量的比较 (s) Table 2 Comparison of the relative volume, thickness and number of bone trabeculae among different groups组别骨小梁相对体积骨小梁厚度(m)骨小梁数量(个)对照1组对照2组实验组FP9.71.311.21.515.31.7a4.3250.03725.43.527.83.632.63.8a4.6230.03a5.1020.028表注：与其余两组比较，aP 0.05。表3 各组血清学骨形态发生蛋白2和转化生长因子水平的比较 (s) Table 3 Comparison of serum bone morphogenetic protein-2 and transforming growth factor- levels among different groups组别骨形态发生蛋白2 (ng/L)转化生长因子 (g/L)对照1组对照2组实验组FP43.510.251.312.672.618.7a5.2170.02784.723.492.832.5123.545.7a5.6320.024表注：与其余两组比较，aP 0.05。3 讨论 Discussion 可注射型生物玻璃的主要成分为SiO2、CaO、P2O3和Na2O，与人体骨类似，在材料界面与人体骨组织之间形成牢固化学键，连接强度提供很高的移植物与界面的稳定性，传导性优于磷酸钙骨水泥。体内实验表明，生物玻璃置入体内后，可在其HCA-胶原层内发现已完成矿化的成熟骨细胞23。生物玻璃具有较好的生物相容性和生物活性，具备骨传导和骨诱导活性，能在组织与材料之间引起细胞内外的反应。Kim等24将45S5生物玻璃制成多孔圆柱体，置入犬肌袋中，3个月后组织学观察植入物内有骨组织形成，证实生物玻璃具有骨诱导活性。Ballas等25-27以明胶为基质，与生物玻璃粉末和同种异体骨粉复合形成的生物材料，具有良好的骨传导及骨诱导活性。骨形态发生蛋白是一种低分子酸性多肽，可诱导间充质细胞向软骨细胞和成骨细胞分化，诱导软骨及骨的再生。将磷酸钙骨水泥与骨形态发生蛋白复合后可使得复合材料兼具骨传导及骨诱导活性，可早期达到植入物与宿主骨界面的稳定融合。Zhang等28-29将磷酸钙骨水泥与骨形态发生蛋白复合，置入大鼠股部肌袋及股骨缺损14 d后发现，肌袋内可见软骨样组织形成，21 d后软骨样组织向骨组织分化。置入骨缺损部位的磷酸钙骨水泥-骨形态发生蛋白复合材料逐渐被新生骨取代。将壳聚糖加载的重组人骨形态发生蛋白2与磷酸钙骨水泥复合，置入山羊骨缺损后，与未复合骨形态发生蛋白的磷酸钙骨水泥组及磷酸钙骨水泥/壳聚糖组相比，复合重组人骨形态发生蛋白2的磷酸钙骨水泥组可显著提高新骨生成，3周全部缺损发生骨连接，6周磷酸钙骨水泥逐渐吸收被新骨替代30-33。另外，在猕猴椎体成形中应用负载重组人骨形态发生蛋白2的磷酸钙骨水泥作为注射剂，2个月磷酸钙骨水泥即发生降解，并有新骨及血管长入，6个月后，磷酸钙骨水泥基本降解完成，被新骨取代34-35。当然，与人体骨组织相比生物玻璃仍然存在一定缺陷，如生物玻璃含有硅，硅在体内不能降解，并且其代谢机制目前仍不很清楚，不论生物玻璃在人体内置入时间的长短，其最终不可能转化为与人体骨组织类似的物质36。磷酸钙骨水泥可任意塑形，具有良好的生物相容性、骨传导性及可降解被新生骨替代等特点，具有广阔的临床应用价值37。新型可吸收生物玻璃注射体吸收两者优点，预计有更佳的应用空间，目前该类研究还较少，通过本实验得出，实验组力学性能更优，表面羟基磷灰石沉积量增多，降解性增大，骨小梁相对体积、厚度和数量增加。 转化生长因子广泛存在于骨组织，参与骨细胞的新陈代谢，调节促骨形成的成骨细胞与促骨吸收的破骨细胞作用，具有骨诱导活性，与磷酸钙骨水泥复合置入体内，可刺激周围骨组织的长入。Miura等38将磷酸钙骨水泥与重组人转化生长因子1复合后，与成骨细胞及成骨前体细胞共培养，发现转化生长因子1不影响成骨细胞的碱性磷酸酶活性，但可明显增加成骨前体细胞的碱性磷酸酶活性；与磷酸钙骨水泥复合后并不影响磷酸钙骨水泥的理化性质，将磷酸钙骨水泥/重组人转化生长因子1置入大鼠颅骨缺损，发现磷酸钙骨水泥/重组人转化生长因子1复合物可促进周围骨生长及提高磷酸钙骨水泥的降解率。另外，复合骨形态发生蛋白2、转化生长因子1、碱性成纤维细胞生长因子及血小板衍生生长因子的磷酸钙骨水泥对成骨具有协同效应39。 生物玻璃颗粒表面缓慢释放的可溶性离子刺激细胞的自分泌反应，包括骨形态发生蛋白、转化生长因子、类胰岛素生长因子、血小板衍生因子及成纤维细胞生长因子等骨诱导分子的分泌40，这些因子不仅在局部，在全身血液中仍可保持高浓度、持续释放，有效提高造骨细胞活性、加速骨及软骨生成、提高植入成功率12。研究表明，将E玻纤与PMMA复合，先制备出表现多孔PMMA复合材料，然后将S53P4生物活性玻璃粉末(粒径315-500 m)引入PMMA复合材料表面的孔隙中，制备出生物活性玻璃/PMMA纤维加强复合材料，置入兔骨缺损中发现，该复合材料具有良好的生物相容性和骨诱导性，能促进骨再生41。He等42将PMMA与生物玻璃及壳聚糖复合制备出复合生物材料，相比PMMA，复合材料浸泡模拟体液表面可短期形成羟基磷灰石沉积，与成骨细胞共培养后可促进成骨细胞增殖和分化，动物实验中复合材料通过材料降解可引导骨长入。利用热压法制得生物玻璃/羟基磷灰石复合材料，与纯羟基磷灰石相比，复合材料可激活成骨细胞，具有良好的生物相容性及生物活性。本实验得出，实验组骨形态发生蛋白2和转化生长因子水平显著高于其他两组。 综上所述，新型可吸收生物玻璃注射体可增强骨质疏松椎体内支撑力，诱导成骨，可能与提高骨形态发生蛋白2和转化生长因子水平有关，是一种十分有应用前景的生物材料。致谢：感谢东营市胜利油田中心医院脊柱外科参与文章撰写的医生护士及东营市胜利油田中心医院影像科。作者贡献：隆海滨进行实验设计，实验实施为隆海滨，实验评估为孙桂森，资料收集为隆海滨，隆海滨成文，孙桂森审校。利益冲突：所有作者共同认可文章无相关利益冲突。伦理问题：在戊巴妥纳麻醉下进行所有实验动物手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。文章外审：本刊实行双盲外审制度，文章经国内小同行外审专家审核，符合本刊发稿宗旨。作者声明：第一作者对于研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。4 参考文献 References1 Mithal A,Dhingra V,Lau E.The Asian audit: Epidemiology, costs and burden of osteoporosis in Asia. Beizing, China: An International Osteoporosis Foundation (IOF) publication,2009.2 Ward E,Munk PL,Rashid F,et al.Musculoskeletal interventional radiology: radiofrequency ablation. Radiol Clin North Am.2008;46:599-610.3 Cummings SR,San Martin J,Mc Clung MR,et al.FREEDOM Trial. Denosumab for prevention of fractures in postmenopausal women with osteoporosis. N Engl J Med.2009;361(8):756-765. 4 Aghaloo T,Felsenfeld A,Tetradis S.Osteonecrosis of the jaw in a patient on denosumab. J Oral Maxillofac Surg.2010;68(5):959-963. 5 Taylor KH,Middlefell LS,Mizen KD.Osteonecrosis of the jaws induced by anti-RANK ligand therapy.Br J Oral Maxillofac Surg.2010;48(3):221-223.6 Xu HHK,Zhao L,Detamore MS,et al.Umbilical cord stem cell seeding on fast-resorbable calcium phosphate bone cement.Tissue Eng A.2010;16: 2743-2753. 7 叶冬平,周子强,梁伟国.一种可注射自固化含锶复合胶原磷酸钙骨水泥的结构和性能J.中国组织工程研究与临床康复,2009,13(38):7411.8 Bone HG,McClung MR,Roux C.Odanacatib, a cathepsin-K inhibitor for osteoporosis: a two-year study in postmenopausal women with low bone density.J Bone Miner Res.2010;25(5):937-947.9 Ginebra MP,Canal C,Espanol M,et al.Calcium phosphate cements as drug delivery materials. Adv Drug Del Rev.2012;64:1090-1110. 10 Lanao RP,Leeuwenburgh SC,Wolke JG,et al. In vitro degradation rate of apatite calcium phosphate cement with incorporated PLGA microspheres. Acta Biomater. 2011;7:3459-3468.11 Yuan H,Bruijn JD,Zhang X,et al.Bone induction by porous glass ceramic made from Bioglass(45S5).J Biomed Mater Res.2001;58(3):270-276. 12 Kirk JF,Ritter G,Waters C,et al.Osteoconductivity and osteoinductivity of NanoFUSE DBM.Cell Tissue Bank. 2013;14(1):33-44. 13 Rojbani H,Nyan M,Ohka K,et al.Evaluation of the osteoconductivity of -tricalcium phosphate, -tricalcium phosphate, and hydroxyapatite combined with or without simvastatin in rat calvarial defect.J Biomed Mater Res Part A.2011;98:488-498.14 Hoppe A,Guldal NS,Boccaccini AR. A review of the biological response to ionic dissolution products from bioactive glasses and glass-ceramics. Biomaterials. 2011; 32(11):2757-2774.15 Gerhardt LC,Widdows KL,Erol MM,et al.The pro-angiogenic properties of multi-functional bioactive glass composite scaffolds.Biomaterials.2011; 32(17): 4096-4108.16 Hautamaki M,Meretoja VV,Mattila RH,et al.Osteoblast response to polymethyl methacrylate bioactive glass composite.J Mater Sci Mater Med.2010;21:1685-1692.17 Nogueira ML,Lucas R,Ramos I,et al.Osteodensimetric curves in a female population.Acta Reumatol Port. 2011; 36(2):126-136.18 Sendtner E,Renkawitz T,Kramny P,et a.l Fractured neck of femur-internal fixation versus arthroplasty. Dtsch Arztebl Int.2010;107(23):401-407.19 Katsumura S,Ezura Y,Izu Y,et al.Beta Adrenergic Receptor Stimulation Suppresses Cell Migration in Association with Cell Cycle Transition in Osteoblasts-Live Imaging Analyses Based on FUCCI System.J Cell Physiol. 2016;231(2):496-504.20 Buckens CF,van der Graaf Y,Verkooijen HM,et al. Osteoporosis markers on low-dose lung cancer screening chest computed tomography scans predict all-cause mortality. Eur Radiol.2015;25(1):132-139. 21 Leite AF,Souza Figueiredo PT,Caracas H,et al. Systematic review with hierarchical clustering analysis for the fractal dimension in assessment of skeletal bone mineral density using dental radiographs.Oral Radiol.2015;31(1):1-13.22 Liu YQ,Han XF,Liu T,et al. A cell-based model of bone remodeling for identifying activity of icarrin in the treatment of osteoporosis.Biotechnol Lett.2015; 37(1): 219-226.23 Gosch M,Druml T,Nicholas JA,et al.Fragility non-hip fracture patients are at risk.Arch Orthop Trauma Surg. 2015;135(1):69-77.24 Kim HJ,Park TJ,Ahn KM.Bisphosphonate-related osteonecrosis of the jaw in metastatic breast cancer patients: a review of 25 cases.Maxillofac Plast Reconstr Surg.2016;38(1):6.25 Ballas EG,Mavrogenis AF,Karamanis E,et al.Low-energy femoral shaft fractures after long-term alendronate therapy: report of seven cases.Eur J Orthop Surg Traumatol.2015;25(1):181-187.26 Schrder K.NADPH oxidases in bone homeostasis and osteoporosis.Cell Mol Life Sci.2015;72(1):25-38.27 Sale JE,Hawker G,Cameron C,et al.Perceived messages about bone health after a fracture are not consistent across healthcare providers.Rheumatol Int. 2015;35(1):97-103.28 Zhang H,Tao X,Wu J.Association of calcitonin receptor gene polymorphism with bone mineral density in postmenopausal Chinese women: a meta-analysis. Arch Gynecol Obstet.2015;291(1):165-172.29 Reid IR.Effects of vitamin D supplements on bone density.J Endocrinol Invest. 2015;38(1):91-94.30 Ishtiaq S,Fogelman I,Hampson G.Treatment of post-menopausal osteoporosis: beyond bisphosphonates.J Endocrinol Invest.2015;38(1): 13-29. 31 Isidori AM,Balercia G,Calogero AE,et al.Outcomes of androgen replacement therapy in adult male hypogonadism: recommendations from the Italian society of endocrinology.J Endocrinol Invest.2015; 38(1):103-112.32 Makita K,Okano H,Furuya T,et al.Survey of the utility of once-monthly bisphosphonate treatment for improvement of medication adherence in osteoporosis patients in Japan.J Bone Miner Metab.2015;33(1): 55-60.33 Horst-Sikorska W,Dytfeld