生物、化学-常用试剂配制.doc

常规试剂配制和测定方法一、 溶液的配制1. Mandels营养盐溶液（1000 mL）名 称重 量（g）硫酸铵（(NH4)2SO4）14磷酸二氢钾（KH2PO4）20尿素 （H2NCONH2）3硫酸镁（MgSO47H2O）3氯化钙（CaCl22H2O） 4注：用煮沸10 min后的蒸馏水配制。2. Mandels微量元素溶液（1000 mL）名 称重 量（g）氯化钴（CoCl26H2O）3.7硫酸锌（ZnSO47H2O）1.4硫酸锰（MnSO4H2O）1.6硫酸亚铁（FeSO47H2O）5.0注：用煮沸10 min后的蒸馏水配制。3. DNS试剂的配制（1000 mL）（1） 取：3,5-二硝基水杨酸 （C7H4N2O7） 7.5 g氢氧化钠 （NaOH ） 14.0 g 充分溶解于1000 mL 水中（水预先煮沸10 min）（2） 加入：酒石酸钾钠 （C4H4O6KNa4H2O） 216.0 g 苯酚（在50 水浴中融化） 5.5 mL 偏重亚硫酸钠 （Na2S2O5） 6.0 g（3） 充分溶解后盛于棕色瓶中，放置5天后便可使用，平时盛一小瓶(250 mL)使用，要放在冰箱中冷藏。此溶液每月配制一次。注意：倒入瓶中时要尽量装满！4. 考马斯亮蓝G-250的配制（1000 mL）称考马斯亮蓝G-250 100 mg即0.1g溶于50 mL 95%乙醇中，加入100 mL 85 %磷酸，用蒸馏水稀释至1000 mL ，滤纸过滤。最终试剂中含0.01 %（w/v）考马斯亮蓝G-250，4.7 %（w/v）乙醇，8.5 %（w/v）磷酸。5. 1.0 M柠檬酸缓冲溶液的配制（1000 mL）名 称分 子 量Mn重 量(g)柠檬酸（C6H8O7H2O）210210NaOH4074.5 准确称取柠檬酸210 g，溶于约750 mL煮沸（10 min）蒸馏水中，待柠檬酸充分溶解后加入氢氧化钠74.5 g，完全溶解后将上述溶液转移到1000 mL容量瓶中，冷却后将容量瓶定容到1000 mL（原始pH4.45）。（检验方法：取1.0 M柠檬酸缓冲溶液稀释20倍，测定稀释液的pH值，pH值应为4.8）6. 标准糖溶液的配制和标准方程的测定（1） 标准糖溶液的配制准确称取2.000 g葡萄糖/木糖（葡萄糖/木糖需105 烘干3 h），蒸馏水溶解，全部转移至1 L容量瓶内，摇匀，配制成2 g/L葡萄糖/木糖溶液。取9个100 mL容量瓶、1支20 mL刻度吸管，分别吸取2 g/L葡萄糖/木糖溶液10 mL、20 mL、30 mL、40 mL、50 mL、60 mL、70 mL、80 mL、90 mL依次加入容量瓶，蒸馏水定容，摇匀。即为0.2 g/L、0.4 g/L、0.6 g/L、0.8 g/L、1.0 g/L、1.2 g/L、1.4 g/L、1.6 g/L、1.8 g/L、2.0 g/L葡萄糖/木糖标准溶液。取6个30 mL容量瓶、1支20 mL刻度吸管，分别吸取2 g/L葡萄糖溶液10 mL、12 mL、14 mL、16 mL、18 mL、20 mL依次加入容量瓶，每瓶再加入1.5 mL柠檬酸缓冲液，蒸馏水定容，摇匀。即为1.0 g、1.2 g、1.4 g、1.6 g、1.8 g、2.0 g酶解葡萄糖。（2） 标准方程的测定： 葡萄糖/木糖标准方程的测定取10支25mL刻度管，10支1mL刻度吸管，分别加入0.2 g/L、0.4 g/L、0.6 g/L、0.8 g/L、1.0 g/L、1.2 g/L、1.4 g/L、1.6 g/L、1.8 g/L、2.0 g/L葡萄糖/木糖标准溶液1 mL，DNS溶液3 mL。100 煮沸5 min，水浴冷却后定容至25 mL，摇匀。以蒸馏水作为空白对照，550 nm测定吸光度A。以A为纵坐标，C为横坐标，制定标准曲线。（7230型分光光度计输出方程为：A = MC + N，723型分光光度计输出方程为：C = KA + B） 酶解木糖标准方程测定（测定木聚糖酶活力）取6支25 mL刻度管，6支2 mL刻度吸管，分别加入1.0 g、1.2 g、1.4 g、1.6 g、1.8 g、2.0 g酶解木糖标准溶液1.5 mL，DNS溶液3 mL，100 煮沸5 min，水浴冷却后定容至25 mL，摇匀。以蒸馏水作为空白对照，550 nm测定吸光度A。以A为纵坐标，C为横坐标，制定标准曲线。（7230型分光光度计输出方程为：A = MC + N，723型分光光度计输出方程为：C = KA + B） 酶解葡萄糖标准方程测定（测定滤纸酶活力、CMC酶活力）取6支小试管，6支2 mL刻度吸管，分别加入1.0 g、1.2 g、1.4 g、1.6 g、1.8 g、2.0 g酶解葡萄糖标准溶液1.5 mL，DNS溶液3 mL，100 煮沸5 min，水浴冷却后，量筒定容至50 mL（定容至25 mL，测定CMC酶活力），摇匀。以蒸馏水作为空白对照，550 nm测定吸光度A。以A为纵坐标，C为横坐标，制定标准曲线。（7230型分光光度计输出方程为：A = MC + N，723型分光光度计输出方程为：C = KA + B）7. 柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的配制pH0.1 mol/L柠檬酸/mL0.2 mol/L磷酸氢二钠/mLpH0.1 mol/L柠檬酸/mL0.2 mol/L磷酸氢二钠/mL2.219.600.405.29.2810.722.418.761.245.48.8511.152.617.822.185.68.4011.602.816.833.175.87.9112.093.015.894.116.07.3712.633.215.064.946.26.7813.223.414.305.706.46.1513.853.613.566.446.65.4514.553.812.907.106.84.5515.454.012.297.717.03.5316.474.211.728.287.22.6117.394.411.188.827.41.8318.174.610.659.357.61.2718.734.810.149.867.80.8519.155.09.7010.308.00.5519.45注：Na2HPO4，Mr =141.98；0.2 mol/L溶液为28.40 g/LNa2HPO42H2O，Mr =178.05；0.2 mol/L溶液为35.61 g/LC6H8O7H2O，Mr =210.14；0.1 mol/L溶液为21.01 g/L二、 酶活力的测定1. 滤纸酶活力的测定纤维素酶的总体酶活力采用国际理论和应用化学协会（IUPAC）推荐的标准方法测定Ghose,T.K., et al,Pure & Appl.Chem.,1987,59,257-268，一个滤纸酶活力的国际单位（FPIU）等于在标准反应条件下每分钟生成1 mol葡萄糖量的酶量。测定方法如下：取7支试管在其中1#-5#支小试管中加入50 mg卷成筒状的滤纸条（1 6cm），适当稀释酶液，取7支试管按下表操作。（5#有底物无酶，6#为有酶无底物空白对照）项 目1#2#3#4#5#6#7#稀释酶液（mL）0.20.30.40.500.5酶解葡萄糖标样1.5mL0.05 M柠檬酸缓冲液（mL）1.31.21.11.01.51将上述试管盖上塑料布，用橡皮筋扎紧后置于恒温水浴器中，保持在振幅80和温度50 下保温60 min后立即取出加入3 mL DNS试剂，在沸水中反应5 min，冷却后加水至50 mL并充分摇匀，待滤纸完全沉淀后，取上层清液于550 nm波长下测定吸光度A值。反应生成的葡萄糖的量根据葡萄糖标准曲线求得。以0.2、0.3、0.4、0.5mL酶量所生成葡萄糖的毫克数为横坐标，酶量的对数为纵坐标作图，从图中找出生成2 mg葡萄糖的酶量，按下式计算样品的滤纸酶活力（FPA）：滤纸酶活力 = 2 mg葡萄糖 60min0.18(mg/mol)生成2mg葡萄糖的酶量（mL）一个滤纸酶活力单位定义为每分钟生成1mol葡萄糖所需的酶量，单位：IU/mL。备注：当加入0.5 mL酶液（指酶液没有被稀释的时候！）仍无法生成2 mg葡萄糖时，按下式计算：滤纸酶活 = 0.185 （葡萄糖mg数）2. -葡萄糖苷酶活力的测定方法一：葡萄糖氧化酶测定法按国际标准方法测定Ghose,T.K.,etal,Pure & Appl.Chem.,1987,59,257-268。一个-葡萄糖苷酶活力国际单位(IU/mL)等于标准条件下每分钟转化1 mol底物即生成2 mol葡萄糖的酶量来表示。预先用0.05 M的柠檬酸缓冲液配制15 mmol/L的纤维二糖溶液（0.513 g纤维二糖/100 mL0.05 M的柠檬酸缓冲液，现配现用） （1） 每个样品应做三个不同酶量估计-葡萄糖苷酶活力（IU/mL） 0.10.10.20.3取酶液量（mL）0.5/0.8/1.00.3/0.5/0.80.2/0.3/0.50.1/0.2/0.3（2） 加料：试管中加入酶液、缓冲液和纤维二糖溶液如下：酶液量（mL）0.05 M柠檬酸缓冲液（mL）纤维二糖溶液（mL）样品适量1酶液1酶液空白110纤维二糖空白011每个试管共2mL，用塑料纸包扎好。注意：纤维二糖溶液必须用0.05M柠檬酸配制。（3） 酶解反应：试管置于50 水浴中，保温30分钟，取出，沸水中放置5分钟使酶失活，冷却至室温。（4） 加显色剂（葡萄糖氧化酶测定试剂）：取试管中冷却液30 L，加入显色剂3.0 mL，混匀；同时做一个葡萄糖标样：取1 g/L葡萄糖标样30 L，加显色剂3.0 mL，混匀；置于37 水浴中，保温15分钟，取出。（5） 测吸光度：505 nm，用蒸馏水调零，测各试管溶液吸光度A值。1g/L葡萄糖标样的吸光度为0.7左右。（6） 计算产生的葡萄糖mg数： 样 品 吸光度测得 酶 空 白 所含葡萄糖 = 2 （mg） 纤维二糖空白 1g/L葡萄糖标样吸光度样品实际产生的葡萄糖 = 测得葡萄糖mg纤维二糖空白葡萄糖mg酶空白葡萄糖mg 酶液量mL （mg）注：纤维二糖空白所产生的响应值，当纤维二糖溶液为新鲜配制时，一般很低。（7） 作图：以log(酶液量mL)为纵坐标，实际产生的葡萄糖mg为横坐标作图，求出生成1 mg葡萄糖时对应的酶液量mL。（8） 计算-葡萄糖苷酶活力：0.0926-葡萄糖苷酶活力 = （IU/mL）生成1mg葡萄糖对应的酶液量（mL）注：当加入1mL酶液仍不能生成1mg葡萄糖时，-葡萄糖苷酶活力 = 0.0926（葡萄糖mg数） 补充：葡萄糖含量测定采用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶终点比色法测定。葡萄糖测定试剂盒由上海荣盛生物技术有限公司生产，内含R1（缓冲液）和R2（酶试剂），使用时将R1和R2等量混合。葡萄糖经葡萄糖氧化酶氧化成葡萄糖酸和过氧化氢，后者在过氧化物酶的作用下，将4-氨基安替比林与苯酚偶联缩合成可被分光光度计测定的醌类化合物。测定该有机化合物的吸光度便能计算出葡萄糖的含量。测定方法如下： 在测定管中加入30 L待测试样的稀释液（空白管、标准管分别以蒸馏水及1g/L的葡萄糖标准溶液代替），每一试管中加入由R1和R2等量混合的酶酚混合液3.0mL，将各试管分别摇匀，置于37水浴中保温15min，冷却至室温后，在7230分光光度计上于505 nm下测定吸光度A值，用空白管校正吸光度到零点，葡萄糖含量按下式计算：测定管吸光度标准管吸光度葡萄糖含量（g/L）= 稀释倍数方法二： 采用pNPG（对硝基苯酚-D-葡萄糖苷）试剂测定（1） 试剂的配制 50 mmol/L , pH 4.8柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的配制（200 mL） 方法：0.1 mol/L柠檬酸 101.4 mL + 0.2 mol/L磷酸氢二钠 98.6 mL 1 mol/L Na2CO3溶液（250 mL）称取：26.5 g Na2CO3溶解后定容至250 mL 5 mmol/L pNPG（分子量：301.25）溶液的配制（100 mL）称取0.1506 g pNPG，用50mmol/L，pH4.8柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液溶解后定容至100 mL。 （2） 对硝基苯酚标准方程的测定 对硝基苯酚标准溶液的配制准确称取0.0209 g 对硝基苯酚（分子量：139.11），蒸馏水溶解，全部转移至100 mL容量瓶内，摇匀，配制成1.5 mmol/L对硝基苯酚溶液。取6个30 mL容量瓶，分别吸取1.5 mmol/L对硝基苯酚溶液1 mL、2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL依次加入容量瓶，蒸馏水定容，摇匀。即为0.05 mmol/L、0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.3 mmol/L、0.4 mmol/L、0.5 mmol/L。 对硝基苯酚标准方程的测定取6支15 mL刻度管、6支1 mL刻度吸管，分别加入0.05 mmol/L、0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.3 mmol/L、0.4 mmol/L、0.5 mmol/L对硝基苯酚溶液1.0mL，再加入2.0 mL 1 mol/L的 Na2CO3溶液和10 mL的蒸馏水，室温放置5 min后，摇匀。以蒸馏水作为空白对照，在400 nm下测定吸光度A。以A为纵坐标，C为横坐标，制定标准曲线。（3） 测定方法游离酶酶活力的测定：0.1 mL适当稀释的酶液与0.9 mL 5 mmol/L pNPG溶液（分别预热5分钟）混合后，于50 下保温10 min。 10 min后立即加入2 mL 1 mol/L Na2CO3溶液终止反应后，再加入10 mL的蒸馏水，摇匀。 在400 nm下测定吸光度。以0.1 mL蒸馏水代替酶液作空白对照。（要做23个平行样，取平均值）固定化酶酶活力的测定：将游离酶酶活的测定方法中0.1mL适当稀释的酶液用0.1mL蒸馏水和一定质量的固定化酶来代替，其余步骤相同。（4） 酶活力的计算一个-葡萄糖苷酶酶活力单位定义为：每分钟水解生成1 mol对硝基苯酚所需要的酶量。计算公式如下： 游离酶酶活力的计算： 生成对硝基苯酚的量（mol） -葡萄糖苷酶酶活 = （IU/mL） 10 min0.1 mL固定化酶活力的计算： 生成对硝基苯酚的量（mol） -葡萄糖苷酶酶活 = （IU/g） 10 min 称取固定化酶的质量（g）3. 羧甲基纤维素（CMC）内切葡聚糖酶活力（1） 在25 mL刻度试管中加入0.5 mL适当稀释的酶液和1.0 mL用0.05 mol/L柠檬酸缓冲液配制的1 %（w/v）羧甲基纤维素悬浮液。（2） 盖上塑料布，用橡皮筋扎紧后置于恒温水浴器中，保持在振幅80和温度50 下保温30 min后立即取出加入3 mL DNS试剂，在100 沸水中煮沸5 min，冷却到室温后，加水定容至25 mL，充分摇匀后于550 nm波长下测定吸光度A值。 （3） 反应生成的葡萄糖的量根据葡萄糖标准曲线求得。按下式计算CMC酶活力：CMC酶活力 = 生成的葡萄糖的量（mg） 30min0.18(mg/mol)0.5mL一个CMC酶活力单位定义为每分钟生成1mol葡萄糖所需的酶量，单位：IU/mL。4. 木聚糖酶活力的测定用0.05 mol/L柠檬酸缓冲液配制的1%（w/v）桦木木聚糖（Sigma公司制造）溶液。适当稀释酶液，取7支25 mL刻度试管按下表操作（5#有底物无酶、6#为有酶无底物空白对照）。项 目1#2#3#4#5#6#7#稀释酶液（mL）0.20.30.40.500.5酶解木糖标样1.5mL0.05M柠檬酸缓冲液（mL）0.30.20.100.511%桦木木聚糖（mL）111110将上述试管盖上塑料布，用橡皮筋扎紧后置于恒温水浴器中，保持在振幅80和温度50 下保温30 min后立即取出加入3 mL DNS试剂，在沸水中反应5 min，冷却到室温后，加水到25 mL，充分摇匀后于550 nm波长下测定吸光度A值。根据木糖标准曲线（用木糖的绝对量对吸光度A值作图），找出反应所产生的木糖量（扣除空白值）。以0.2、0.3、0.4、0.5 mL酶量所生成木糖的毫克数为横坐标，酶量的对数为纵坐标作图，从图中找出生成2 mg木糖的酶量，按下式计算木聚糖酶活力：木聚糖酶活力 = 2mg木糖 30 min0.15(mg/mol)生成2mg木糖的酶量一个木聚糖酶活力单位定义为每分钟生成1mol木糖所需的酶量，单位：IU/mL。三、木聚糖的测定方法1、准确吸取5mL搅拌均匀的木聚糖溶液于250 mL