菌落总数与大肠菌群数测定.ppt

菌落总数与大肠菌群数测定 主要内容 菌落总数测定大肠菌群测定MPN法原理 拓展内容 菌落总数测定 掌握菌落总数测定方法实验原理不同稀释度的样品 营养琼脂培养基 36 48h 水产品30 72h 菌落数 菌落总数测定 器材与试剂 样品 无菌生理盐水 平板计数琼脂培养基 1ml吸管 培养皿 菌落总数测定 倾注培养 培养结果 菌落总数测定 实验步骤5 菌落计数 肉眼观察 可用放大镜 可标记必要时分区计数 菌落成片者作废计算方法某稀释度的菌落数 两平板菌落数取平均值选择菌落数在30 300之间的稀释度 1 仅有一个稀释度在此范围 菌落数 稀释倍数 菌落总数测定 计算方法 2 有两个稀释度在30 300之间菌落数之比 2 选较小值菌落数之比300取稀释倍数最大者 4 所有稀释度均 30取稀释倍数最小者 5 没有任何稀释度在30 300之间选最接近该范围者结果单位 CFU ml g 菌落总数测定 注意事项 1 无菌操作2 标记3 何时更换吸管4 吸吹混匀5 琼脂培养基保温6 安全常识 大肠菌群数测定 实验目的实验原理36 48h 产气 小倒管 三步法 初发酵 复发酵器材与试剂样品 无菌生理盐水 LST肉汤 BGLB肉汤1ml吸管 10ml吸管 试管 小倒管 初发酵 器材与试剂样品 225ml无菌生理盐水 9ml无菌生理盐水 双料LST肉汤 单料LST肉汤 10ml吸管 1ml吸管 吸球 大肠菌群数测定 实验步骤 1 初发酵 吸取样品方法 加注样品 初发酵结果 右边为阳性结果 小倒管内有气体产生 实验步骤3 复发酵 1 选取产气试管 2 接种至10mlBGLB肉汤中 3 培养 36 48h 4 观察指标 若产气则报告大肠菌群阳性 大肠菌群数测定 实验步骤2 分离培养 1 制备伊红美蓝平板 45 无菌 倾注 15ml 2 选产酸产气的发酵管 3 接种至伊红美蓝平板分区划线法 4 培养 36 48h 分离培养 器材与试剂初发酵结果 4只发酵管 酒精灯 接种环 伊红美兰平板培养基 分区划线法 2020 3 17 23 可编辑 分区划线法 操作要点1 划下一个区前必须灭菌接种环2 划线时接种环同平板呈30 40 角3 每次划线应该压到上一个区域的2 3条线4 用接种环的 面 而不是 弧 在平板上滑动 大肠菌群数测定 实验步骤2 分离培养 5 菌落特征 深紫黑色 有金属光泽紫黑色 无或略有金属光泽淡紫红色 中心颜色深 6 革兰染色 镜检 选特征菌落 革兰染色法 器材与试剂结晶紫 卢戈碘液 95 乙醇 酸性复红 生理盐水 酒精灯 载玻片 滤纸 革兰染色法 涂片 接种环 挑取菌落 生理盐水一滴 涂匀热固定 通过火焰若干次初染 结晶紫一滴 1min 水洗媒染 卢戈碘液一滴 1min 水洗脱色 95 乙醇 30s或至无色为止复染 复红一滴 30s 涂片 热固定 初染 媒染 脱色 复染 革兰氏染色阴性 革兰氏染色阳性 革兰染色法 复发酵 器材与试剂培养24小时后的伊红美兰平板 酒精灯 接种环 复发酵管 大肠菌群数测定 实验步骤3 复发酵 1 选取鉴定为无芽孢G 杆菌的菌落1 3个 2 接种至10ml乳糖蛋白胨培养液 3 培养 37 24h 4 观察指标 产酸 产气 液体接种 复发酵 复发酵阳性结果 培养基变成黄色 小倒管内有气体产生 大肠菌群数测定 注意事项 1 无菌操作2 吸管使用3 洗去染液的方法4 显微镜保养5 液体接种 MPN法原理 MPN法 MostProbableNumberMethod 目的 对某种细菌进行选择性计数核心思想 泊松分布实施方法 多次稀释直至无菌 每个稀释度分别接种若干培养管 根据阳性管数估算MPN值 MPN法原理 MPN法 MostProbableNumberMethod 1 细菌进入发酵管的概率近似服从泊松分布 P x k e x xk k x 细菌浓度 k 进入发酵管的细菌数2 若在n管发酵中 令接种水样量为Vi 阳性管数为Pi 阴性管数为Qi 则该检验结果发生的概率为 其中C为常系数V为总水样量 x为细菌个数 MPN法原理 3 当y x max X MPN4 由于y x 为单极值函数 令dy dx 0