实验 亲和层析纯化IgGppt.ppt

生物分离与纯化实验 共34学时 持续改进协作实验报告 1 信息栏填全 遗漏项 同组人员 2 结果计算 过程完整3 讨论分析不可缺项 内容丰满 见解细致 上次实验总结 实验 三 血清中抗体纯化 16学时 配基特异性ProteinA许多IgGs的Fc片断ProteinG许多IgGs的Fc片断Antigen特异的抗体Anti IgG特异免疫球蛋白 抗体纯化配基类型 二 实验原理 低pH下洗脱 用rProteinASepharose 分离IgGColumn HiTrap ProteinAFF结合缓冲液 20mM磷酸钠 pH7 0洗脱缓冲液 0 1M甘氨酸 HCl pH3注意 为了保护抗体的活性 将洗脱组分收集于1MTris HCl pH7 5中 二 实验原理 二 实验原理蛋白A和蛋白G的结合特异性 种属蛋白A蛋白G结合结合人IgA可变的 IgD IgEIgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgM 可变的 鸟类蛋黄IgY 牛 狗 山羊 豚鼠IgG1 IgG2 仓鼠 马 考拉 骆驼 种属蛋白A蛋白G结合结合恒河猴 大鼠IgG1 IgG2a IgG2b IgG3 IgM 可变的 猪 兔 小鼠IgG1 IgG2a IgG2b IgG3 绵羊 相对结合强度 弱或不结合 三 实验材料 纯化 试剂 磷酸二氢钠 磷酸氢钠 氯化钠 异地酸二钠 枸橼酸 精氨酸 盐酸胍 氢氧化钠 95 乙醇 均为分析纯 容器 50ml烧杯 三角瓶 试管10个 15ml收集试管5个 100ml三角瓶5个 250ml烧杯5个填料 ProteinA层析柱 XK10或预充柱装柱体积 2ml血清 2ml滤器 0 45 m针头式滤器5个 SDS PAGE 缓冲液 平衡液 20mM磷酸二氢钠 150mM氯化钠 pH7 2 1L 冲洗液 20mM磷酸二氢钠 0 5M氯化钠 10mMEDTA二钠 pH7 2 1L 洗脱液 0 1MGlycine HCl pH3 5 1L 清洗液 6mM氢氧化钠 1L 稀释血清 取2ml血清 用平衡缓冲液稀释5倍 0 45um针头滤器过滤 标记为S 三 实验材料 纯化 三 实验材料 SDS PAGE 试剂 1 2x样品缓冲液2 凝胶贮液 在通风橱中 称取丙烯酰胺30g 甲叉双丙烯酰胺0 8g 加重蒸水溶解后 定容到100ml 过滤 3 pH8 9分离胶缓冲液 Tris36 3g 加1mol LHCl48ml 加重蒸水80ml使其溶解 调pH8 9 定容至100ml 4 保存 4 pH6 7浓缩胶缓冲液 Tris5 98g 加1mol LHCl48ml 加重蒸水80ml使其溶解 调pH6 7 定容至100ml 4 保存 5 TEMED 四乙基乙二胺 原液6 10 过硫酸铵 用重蒸水新鲜配制 7 pH8 3Tris 甘氨酸电极缓冲液 称取Tris6 0g 甘氨酸28 8g 加蒸馏水约900ml 调pH8 3后 用蒸馏水定容至1000ml 置4 保存 临用前稀释10倍 减半配制 8 考马斯亮蓝G250染色液 称100mg考马斯亮蓝G250 溶于200ml蒸馏水中 慢慢加入7 5ml70 的过氯酸 最后补足水到250ml 搅拌1小时 小孔滤纸过滤 器材 电泳仪 电泳槽 水浴锅 摇床 三 实验试剂 浓度测定 考马斯亮蓝G 250蛋白染色液 1 牛血清白蛋白标准液 100ug ml 精确称取0 010g牛血清白蛋白 溶于约50ml蒸馏水 定容到100ml 2 考马斯亮蓝G 250试剂取100mg考马斯亮蓝G 250 溶于50ml90 乙醇中 加入85 正磷酸100ml 最后用蒸馏水定容到1000ml 此试剂在常温下可放1个月 四 实验步骤 1 ProteinA纯化 1 装柱 固定好层析柱 柱保持垂直 夹上出入口止水夹 量取20ml蒸馏水加入柱内 在柱外做一体积为20ml的标记 然后打开止水夹赶去出口内气泡 最后在柱内保留0 5 1m的水 ProteinA填料中加入适量平衡缓冲液 小心搅起凝胶 尽量一次加入柱内 待上层有一水层后打开止水夹 再用20 40ml平衡缓冲液不断加入柱内洗脱 最后待胶床表面仅有1 2厘米液层时 旋紧止水夹 装好的胶柱应符合无气泡 无节痕 床面平正 2 上样 血清让胶床表面几乎不留液层 然后小心注入床面中央 2ml稀释血清 待样液几乎全部进入胶床表面后 关止水夹 室温下样品与填料结合15min 实验步骤1 ProteinA纯化 3 冲洗 加2倍柱体积冲洗缓冲液 打开止水夹 控制流出速度为2ml min 并用试管收集流出液 记为W 在床表面仅有1毫米左右液层时 关止水夹 再加入2倍柱体积平衡缓冲液冲洗填料 床表面仅有1毫米左右液层时 关止水夹 4 洗脱收集 取刻度试管2支编号 柱床上面加3倍柱体积洗脱缓冲液 控制止水夹流出1倍柱体积洗脱液后 关止水夹 室温下柱料与洗脱液孵育15min 打开止水夹控制流出速度为1ml min收集2倍柱体积 记为E1 待床表面仅有1毫米左右液层时再加入3倍柱体积洗脱缓冲液 收集2倍柱体积记为E2 5 收集结束后 加入清洗液 6MNaOH 洗涤2cv 平衡液5cv 2020 3 18 13 可编辑 分离胶及浓缩胶的制备 1将玻璃板 样品梳 Spacer用洗涤剂洗净 用ddH2O冲洗数次 再用乙醇擦拭 晾干 2将两块洗净的玻璃板之间加入Spacer 按照说明书提示装好玻璃板 3按以下配置10 分离胶及浓缩胶 四 实验步骤2 SDS PAGE纯度测定 3 按比例配好分离胶 用移液管快速加入 大约5cm左右 之后加少许蒸馏水 静置30分钟 凝胶配制过程要迅速 催化剂TEMED要在注胶前再加入 否则凝结无法注胶 注胶过程最好一次性完成 避免产生气泡 水封的目的是为了使分离胶上延平直 并排除气泡 凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面 4 倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干 按比例配好浓缩胶 连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处 迅速插入样梳 静置10分钟 样梳需一次平稳插入 梳口处不得有气泡 梳底需水平 四 实验步骤2 SDS PAGE纯度测定 5 样品处理 还原样品 取30ul样品 S W E1E2 加入30ul还原上样缓冲液 100 水浴5min 非还原样品加入30ul非还原上样缓冲液室温孵育5min 6 加样 拔出样梳后 空出第一个孔 从第二个开始按已编排好的顺序依次加入相应体积的样品和蛋白Marker 其中S和Marker加样量为2 l W E1 E2加样量为15 l 还原与非还原样品间空一孔道 注射器不可过低 以防刺破胶体 也不可过高 在样下沉时会发生扩散 为避免边缘效应 最好选用中部的孔注样 四 实验步骤2 SDS PAGE纯度测定 7 电泳槽中加入缓冲液 接通电源 进行电泳 开始电压恒定在160V 当进入分离胶后改为240V 溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时 停止电泳 8 凝胶板剥离与染色 电泳结束后 用专用工具撬开短玻璃板 从凝胶板上切下一角作为加样标记 然后放在大培养皿内 加入染色液微波煮沸后 染色10min左右 剥胶时要小心 保持胶完好无损 染色要充分 9 脱色 染色后的凝胶板用蒸馏水冲洗染色液 再用微波煮沸后的脱色液脱色 可更换2次 直到蛋白质区带清晰 四 实验步骤2 SDS PAGE纯度测定 实验步骤3 蛋白质含量测定 1 取洗脱液E1 E20 5毫升 用蒸馏水稀释至5毫升 然后吸取稀释后的酶洗脱液G 250 5毫升 用考马斯亮蓝G 250染色法测定其蛋白质含量 管号 数量 项目 标准曲线的制作和