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HPLC在合成多肽分离与纯化中的应用杜雾晨摘要：固相肽合成（SPPS）技术是目前制备各种模式多肽和天然多肽类似物的最有效方法，但是最终产物的成分往往比较复杂，不经纯化难以用于蛋白质多肽的结构、功能和药理学研究。近年来已出现了多种多肽及蛋白质的分离纯化技术，高效液相色谱法（HPLC）是目前分析纯化合成多肽的主要手段。本文根据固相肽合成方法的原理及产物特点，对高效液相色谱法在分析纯化合成肽中的应用作了较为系统的评述。关键词：固相肽合成；纯化；高效液相色谱法多肽是分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物,由一种或多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成。多肽是构成蛋白质的结构片段,也是蛋白质发挥作用的活性基团,是人体进行代谢、调控活动的重要物质。蛋白质主要以多肽形式吸收,透过多肽既可深入研究蛋白质的性质,又为改变和合成新的蛋白质提供了基础材料。研究多肽结构与功能的关系,有助于了解多肽中各氨基酸系列的功效,以便应用中设计尽可能短的多肽同时提高其生理活性,减少临床的不良反应。多肽类药物在临床上显示了巨大的应用价值,受到药物化学家越来越多的重视,多肽药物的研究和开发成为国际新药技术领域竞争中的重要方面。化学合成的肽产品是一个纯度不好的粗产品,其一是因为在合成肽过程中各种副反应、消旋化等造成的副反应肽,二是在脱保护过程中,由于保护基的残留,肽键的断裂、烷基化等造成的杂质。杂质的分子结构与合成肽很相似,或许二者之间仅仅在某一个位置的氨基酸残基不同,或许二者之间的差异仅仅在某一氨基酸残基侧链上某一基团是否存在等等。由于杂质与合成的肽在分子结构和化学性质上如此相似,就给肽的分离纯化带来了困难1。因此,根据对目的肽的要求,需要选择适当的方法进行纯化。高效液相色谱(HPLC)是生物技术中分离纯化的重要方法,在多肽、蛋白质的分离纯化工艺中显示出优异的性能。而且,它已走出实验室投入到大规模的工业化生产中,成为生物技术范围内一有力高效的分离工具2。1 多肽的合成1.1多肽合成的分类多肽的合成主要有两条途径:化学合成和生物合成。化学合成主要是以氨基酸与氨基酸之间缩合的形式来进行。在合成含有特定顺序的多肽时，由于合成原料中含有官能度大于2 的氨基酸单体，合成时应将不需要反应的基团暂时保护起来，方可进行成肽反应，这样保证了合成目标产物的定向性。多肽的化学合成又分为液相合成和固相合成。多肽液相合成主要分为逐步合成和片段组合两种策略。逐步合成简洁迅速，可用于各种生物活性多肽片段的合成。片段组合法3主要包括天然化学连接和施陶丁格连接。近年，多肽液相片段合成法发展迅速，在多肽和蛋白质合成领域已取得了重大突破。在多肽片段合成法中，根据多肽片段的化学特定性或化学选择性，多肽片段能够自发进行连接，得到目标多肽。因为多肽片段含有的氨基酸残基相对较少，所以纯度较高，且易于纯化。1963 年，美国著名生物化学家 Merrifield 提出了固相合成法，开展了多肽固相合成，即将氨基酸的C末端( 羧基端) 连接在不溶树脂上，然后在此树脂上依次进行氨基酸的缩合、延长肽链。固相合成方法可分为叔丁氧羰基( Boc)方法和 9-芴甲基氧羰基( Fmoc) 方法4。人们以多肽的液相和固相合成方法为基础又发展了氨基酸的羧内酸酐( NCA) 法、组合化学法等。多肽的生物合成方法主要包括发酵法、酶解法，随着生物工程技术的发展，以 DNA 重组技术为主导的基因工程法也被应用于多肽的合成。1.2 多肽的固相合成Merrifield创建并发展了多肽的固相合成方法之后,多肽研究领域发生了划时代的变化。固相方法以快速简便的操作和高产率显示了无可比拟的优越性,应用这一神奇的方法几乎可以随心所欲地合成任何多肽。其基本原理如下图所示: 图1 多肽的固相合成原理多肽的合成是氨基酸重复添加的过程，通常从C端向N端( 氨基端) 进行合成。多肽固相合成的原理是将目的肽的第一个氨基酸C端通过共价键与固相载体连接，再以该氨基酸 N 端为合成起点，经过脱去氨基保护基和过量的已活化的第二个氨基酸进行反应，接长肽链，重复操作，达到理想的合成肽链长度，最后将肽链从树脂上裂解下来，分离纯化，获得目标多肽。显然,用固相方法合成具有特定氨基酸顺序的多肽必须满个条件:一是通常把要合成多肽的羧基端键合到固相载体上,然后从氨基端逐步增长肽链;二是需要对暂不参与形成酰胺键的氨基加以保护,同时对氨基酸侧链上的活性基团也要保护,反应完成后再将保护基团除去;三是对参与形成酰胺键的羧基必须进行活化4。1.2.1 聚合物载体和连接分子考虑到固相合成多肽的特殊性,用于固相合成多肽的载体在合成条件下应是惰性的、不溶性的交联聚合物,并能够对单体中活性基团进行选择性保护和去保护;连接反应物到载体上的方法应便于在合成过程中分析反应过程且最后给出目标物时,可以选择性地从载体上裂解下一部分或全部产物。载体有两种类型可供选择,一种是微孔溶胀型,另一种是大孔非溶胀型。非溶胀型树脂反应后易于过滤回收,活性基的可接近性好,对反应物的扩散阻力小,几乎可在任何溶剂中使用;溶胀型树脂机械强度高,不易破坏,功能基化反应速度快,负载容量高,但须在溶胀性能良好的溶剂(如氯仿、二氯甲烷、苯、二氯六环、四氢呋喃等)中使用。在大多数固相合成多肽中,溶胀型树脂均优于非溶胀型树脂5。图2 固相合成中常用的树脂在固相合成中,连接分子发挥着重要作用，它决定着从固相载体上把产物裂解下来的方法以及产物末端所暴露出来的功能团。固相合成多肽曾经使用过键合不同连接分子的聚合物,这些连接分子为含有氯甲基、巯甲基、酰氯基、对苯甲酰基、芳磺酰氯基、烯丙醇基、丁二酰基、邻硝基苄醇基及二苯氯硅烷等的双官能团化合物。一个理想的连接分子必须在整个合成过程中十分稳定,并在合成后可以定量的切割下来而又不破坏合成的目标分子61.2.2 氨基的保护方法氨基是亲核性很强的基团。氨基经酰化后,亲核性消失,因此对游离氨基实施酰化是保护氨基的基本方法。但是,考虑到肽键形成后,应能在温和条件下将保护基除去,因此对氨基保护基有特殊要求。常用的氨基保护基有9-芴甲氧羰基(Fmoc) ,叔丁氧羰基(tert- butoxycarbonyl group,简称t-Boc)。图3 BOC和FMOC1.2.2.1 Boc合成法Boc方法是经典的多肽固相合成法，以Boc（叔丁氧羰基）作为氨基酸-氨基的保护基，苄醇类作为侧链保护基，Boc的脱除通常采用三氟乙酸 (TFA) 进行。合成时将已用Boc保护好的 N-氨基酸共价交联到树脂上，TFA切除Boc保护基，N端用弱碱中和。肽链的延长通过二环己基碳二亚胺(DCC)活化、偶联进行，最终采用强酸氢氟酸(HF) 法或三氟甲磺酸(TFMSA)将合成的目标多肽从树脂上解离。在Boc合成法中，为了便于下一步的合成，反复用酸进行脱保护，一些副反应被带入实验中，例如多肽容易从树脂上切除下来，氨基酸侧链在酸性条件不稳定等7。1.2.2.2 Fmoc合成法 Carpino和Han以Boc合成法为基础发展起来一种多肽固相合成的新方法Fmoc 合成法。Fmoc合成法以Fmoc（9-芴甲氧羰基）作为氨基酸-氨基的保护基。其优势为在酸性条件下是稳定的，不受TFA 等试剂的响，应用温和的碱处理可脱保护，所以侧链可用易于酸脱除的Boc保护基进行保护8。肽段的最后切除可采用TFA二氯甲烷(DCM) 从树脂上定量完成，避免了采用强酸9。同时，与Boc法相比，Fmoc法反应条件温和，副反应少，产率高，并且Fmoc基团本身具有特征性紫外吸收，易于监测控制反应的进行10。Fmoc 法在多肽固相合成领域应用越来越广泛。1.2.3 接肽反应方法目前多肽合成中，主要采用羧基活化方法来完成接肽反应，最早使用的是将氨基酸活化为酰氯，叠氮，对称酸酐以及混合酸酐的方法，但是由于这些条件下，存在氨基酸消旋、反应试剂危险以及制备比较复杂，因此适合于固相上的接肽反应的方法较少,如缩合剂法、混合酸酐法和原位法等。1.2.3.1原位法(DCC法)直接加二环己基碳二亚胺(DCC)和保护氨基酸到树脂中进行反应的方法称为原位法（DCC法）。该法操作简便,反应速度快,产率高。但其主要缺点是,在反应中生成的副产物(DCU)在接肽溶剂(DCM)中的溶解度很小,要将其洗涤除去需花费大量的溶剂和时间,甚至虽经多次洗涤,仍会有少量吸附在树脂内部的空隙中而影响以后的反应。而且,活化和缩合在一起进行,前述副产物若不能预先除去,就会有连接在肽上的危险11。1.2.3.2 对称酸酐法对称酸酐法是一种非常好的接肽方法,操作简单,产物纯度很好,尤其适合小分子肽的合成12其优点还有:接肽反应后的产物中不存在用DCC法时所产生的、溶解度较小的DCU副产物;活性很高,接肽反应的速度很快,大多数保护氨基酸酐的接肽反应时间只需1530s即可达到99%,少数空间阻碍较大的保护氨基酸酐的接肽反应也只要38min即可达到99%,因此,如果用对称酸酐进行固相接肽反应,当反应物浓度为0.1mol L时,一般在10min内即已测不到游离的氨基;缩合的产率很高,每次接肽的产率可达99.6%99.8%12。对称酸酐可以被合成,并以结晶的形式存在,有利于保存。只是由于制备一分子的对称酸酐需要两分子的保护氨基酸,因此对称酸酐法的一个主要缺点是保护氨基酸的用量大,比较浪费。另一个需要注意的问题是保持树脂的溶胀性非常重要13。1.2.3.3 缩合剂法在DCC缩合反应中,加入某些添加剂不仅可减少副反应,而且可提高产率。常用的添加剂有N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu),1-羟基苯并三氮唑(HOBt)和3-羟基-4-氧-3, 4-二氢-1, 2, 3-苯并三氮嗪(HOObt)14。DCC-HOBt作用机制如图所示：图4 DCC-HOBt缩合反应原理1.2.4 脱去保护基和树脂合成肽的最终脱保护基和从树脂上裂解不仅决定合成的成败,而且也决定了侧链保护基的选择等固相合成多肽的计划的确立,因此是肽合成中极重要的环节。Na/液氨法是较早使用的方法,但因为强碱性反应会引起某些副反应,已不太常用。目前最常用的脱保护基系统是三氟乙酸(TFA),HF15,有机磺酸(TFMSA,MSA)和含硅试剂(TMSBr、TM-SOTf)。TFA(三氟乙酸)法可以脱除一些不耐酸的保护基,如Boc、t-Bu、金刚烷氧羰基(Adoc)、Trt等。本法比较温和,副反应少,越来越多地应用于固相合成法中15。TFA法脱除保护基及裂解树脂上肽链的操作比较简单,只要在样品中加入适量三氟乙酸振摇或搅拌至完全溶解,反应时间随具体情况而定4。多肽广泛存在于自然界中，对多肽的研究和应用一直是科学研究的一个主要方向。生物活性多肽由于具有多种人体代谢和生理调节功能，且可作为药物或药物前体，食用安全性极高而广泛受到人们的关注，因此多肽的分离纯化也成了一个研究热点。随着分离纯化技术的进展，大大加快了新活性多肽的发现和合成速度。在多肽合成中，许多杂质显示与产物类似的性质，随着肽链的增长，分离的难度也增大，因此纯化的方法和工艺显得异常重要。近年来，随着生命科学研究的不断深入，用于多肽分离纯化的方法得到了很大发展，其中，高效液相色谱由于具有许多其它方法不可比拟的优势，正受到人们的关注。2 高效液相色谱分离纯化多肽的研究进展近年来有关多肽的分离纯化方法很多，常见的有高效液相色谱法、超滤法、高效毛细管电泳法等，其中高效液相色谱法应用较为广泛，其分离效果好，速度快，样品容量大，回收率高，已成为生物多肽的主要分离纯化方法之一16。HPLC根据样品在固定相和流动相分离过程的物理化学原理不同可分为离子交换色谱、凝胶过滤色谱和反相高效液相色谱等。2.1 离子交换色谱离子交换色谱（Ion Exchange Chromatography,IEC）是以离子交换剂作为固定相，交换剂由固定离子基团及可交换的平衡离子组成。当流动相带着组分离子通过离子交换柱时，组分离子与可交换的离子进行可逆变换，最后达到交换平衡。离子交换色谱法的原理就是根据不同组分离子对固定离子基团的亲和力的差别而达到分离的目的。离子交换色谱又可分为阳离子交换色谱和阴离子交换色谱。离子交换色谱可在近中性条件下利用多肽带电性的不同进行分离纯化。刘璇等17利用凝胶过滤层析Sephadex G-75，通过强阳离子交换色谱SP-650M，从苦瓜籽中分离纯化出一种具有双功能作用的活性多肽对于不同的多肽提取，所选用的离子交换剂不同，因此环境条件及洗脱条件的确定非常重要，一旦条件选取不当，分离纯化效果将会很差。故而，对于各种多肽，研究其最适离子交换剂及其对应最适条件以不断提高提取效果是研究工作者的研究方向。2.2 凝胶色谱法凝胶色谱法（Gel Filtration Chromatography, GFC）是一种简便而有效的液相柱层色谱技术。它利用某些化学惰性的多孔网状结构的物质为填料，通过洗脱液的连续洗脱，使混合物中的各种物质按其分子大小不同得到分离。凝胶过滤层析所需设备简单，具有操作方便、分离迅速，以及不影响样品的生物活性等优点，广泛应用于大分子物质的分离纯化。孙培龙等18通过Superose-12凝胶层析、DEAE Sepharose F.F.离子交换层析等手段，对油菜蜂花粉中60%80%硫酸铵盐析出物进行分离纯化研究，得到一个分子量为36.3k D纯度很高的多肽。凝胶色谱也被科研工作者广泛应用于抗氧化性多肽及其它新型多肽的开发上，如周媛媛等19对水解制得的大豆多肽进行超滤膜过滤后，对得到的相对分子质量6000以下的多肽，用葡聚糖凝胶Sephadex LH-20进行凝胶色谱分离纯化，经研究表明，抗氧化性最好的组分a和组分b的相对分子质量分别约为630和310.凝胶色谱法在分离纯化多肽中应用广泛，但由于色谱柱峰容量有限，分离度较低，不宜用于分子大小及组成相似或相差很小组分的分离，因此通常可作为一种初步分离复杂混合物的手段。使下一步的纯化达到更好的效果，往往需要与其它技术联用，得到高纯度的分离纯化结果。2.3 反相高效液相色谱反相高效液相色谱（RP-HPLC）是利用非极性的反相介质为固定相，极性有机溶剂或其水溶液作为流动相，根据溶质疏水性的差别进行分离纯化的洗脱色谱法。RP-HPLC主要用于分子量低于5000的多肽的分离纯化，因其具有分离效果好、分辨率高、重复性好、分析速度快等优点，在多肽的分离纯化和制备中得到广泛应用。2.4 高效液相色谱与其他分离纯化方法联用肽的种类很多且大多具有相似性，使用单一的分离纯化手段已经不能达到理想的分离纯化效果。HPLC有可以进行大规模制备等优点，但存在费时、价高等缺点，因此高效液相色谱与其他分离纯化方法联用技术在多肽分离纯化中已显示出巨大的优越性。任娇艳20运用超滤、离子交换色谱、逆流色谱及凝胶色谱等多种分离技术对草鱼蛋白肽进行逐级纯化。高效液相色谱与其他分离纯化方法的联用技术，集中了各种方法的优势，弥补了各技术的不足，在多肽及其他大分子分离纯化的研究上，越来越受到国内外的重视。3 总结近年来，有关各种活性多肽的化学合成有了很大的发展，但产物成分比较复杂，一般是以目标多肽为主的几种结构相似的多肽混合物，因此，对这一混合物的分离纯化一直是一个重要的研究课题，对其分离纯化的最优化研究也就显得格外重要。目前，高效液相色谱已成为分离纯化多肽行之有效的方法之一，与经典分离纯化方法相比，高效液相色谱分离具有效果好、速度快、分辨率高、灵敏度高等优点，有较强的适用性。其次，高效液相色谱在适宜的色谱条件下不仅可以在短时间内完成对多肽的分离目的，更重要的是该法能在制备规模上生产具有生物活性的多肽。然而，目前高效液相色谱分离纯化工艺尚不完全成熟，成本较高且费时，有待于科研工作者进一步优化其条件或找到一种较适于分离纯化多肽的方法。参考文献1张艳华,李影,巨芳等.高效液相色谱分离纯化多肽的研究进展J.中国食物与营养,2009(09):34-36.2王立晖，袁永俊，孙勇民等.生物活性多肽分离与检测的研究进展.农产品加工，2008，6:21-27.3麻远,赵玉芬.多肽片段连接:合成蛋白质的一种新方法J.科学通报,2002(16):1201-1205.4韩香,顾军.固相法在多肽合成领域的应用J.药学进展,2004(01):10-14.5Krishna Kumar M, Rajasekharan Pillai V N, Mathew B. 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