烟叶游离氨基酸的测定氨基酸分析仪法.doc

烟叶游离氨基酸的测定氨基酸分析仪法烟叶游离氨基酸的测定 氨基酸分析仪法(YC/T 2822009) 日期:2009/6/2 10:39:18 作者: 来源: 烟叶游离氨基酸的测定 氨基酸分析仪法(YC/T 2822009)由国家烟草专卖局于2009年3月30日批准发布，自2009年5月1日起实施。 前 言 本标准的附录,、附录B、附录C为资料性附录。 本标准由国家烟草专卖局提出。 本标准由全国烟草标准化技术委员会卷烟分技术委员会(TC144/SC1)归口。 本标准起草单位:湖北中烟工业有限责任公司、中国烟草总公司郑州烟草研究院。 本标准主要起草人:王娟、李丹、刘建锋、马舒翼、宋旭艳、郭国宁、刘克建。 烟叶 游离氨基酸的测定 氨基酸分析仪法 1 范围 本标准规定了烟叶中游离氨基酸的氨基酸分析仪测定方法。 本标准适用于烟叶中天冬氨酸(Asp)、苏氨酸(Thr)、丝氨酸(Ser)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酸(Glu)、脯氨酸(Pro)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、)、胱氨酸(Cys)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、酪氨酸(Tyr)、缬氨酸(Val苯丙氨酸(Phe)、-丙氨酸(-Ala)、-氨基异丁酸(-Aia)、-氨基丁酸(-Aba)、赖氨酸(Lys)、组氨酸(His)、色氨酸(Trp)、精氨酸(Arg)等21种游离氨基酸的测定。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 YC/T 31-1996 烟草及烟草制品 试样的制备和水分测定 烘箱法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 烟叶中游离氨基酸 dissociated amino acid(free amino acid)in tobacco leaf 烟叶的盐酸浸出物中，以游离状态存在、未结合在蛋白质分子中的氨基酸。 4 原理 氨基酸为两性电解质，在酸性环境下形成阳离子。烟叶中的游离氨基酸经酸溶液萃取后，经氨基酸分析仪的磺酸型锂离子交换柱分离，然后与茚三酮混合，通过加热反应，伯胺与之生成蓝紫色化合物，仲胺与之生成黄色化合物。两种衍生物使用波长分别为570 nm和440 nm的双通道紫外检测器同时进行定性定量分析测定(氨基酸分析仪管路图参见附录A)。 5 试剂 除特别要求以外，本标准所使用的试剂均为分析纯试剂，水为去离子水。 5.1 盐酸溶液，0.005 mol/L。 准确移取420 L浓盐酸(质量分数为36%,38%)于1000mL容量瓶中，用水定容至刻度。此溶液作为萃取溶液。 5.2 样品稀释液，pH 2.20。 准确称取四水柠檬酸三锂11.3 g，柠檬酸6.0 g，溶于500 mL水中，后加入20 mL 25 %(质量分数)硫二甘醇溶液和15 mL 32 %(质量分数)盐酸溶液。转移至1000mL容量瓶中，用水进行定容。 1)5.3 锂离子缓冲溶液 5.3.1缓冲液A，pH 2.95)。 准确称取四水柠檬酸三锂11.3 g，柠檬酸6.0 g，溶于500 mL水中，后加入50 mL甲醇溶液和9 mL 32 %(质量分数)盐酸溶液，转移至1000mL容量瓶中，用水进行定容。 5.3.2缓冲液B，pH 4.20。 准确称取四水柠檬酸三锂18.8 g，氯化锂4.2 g，溶于500 mL水中，后加入6 mL 32 %(质量分数)盐酸溶液，转移至1000mL容量瓶中，用水进行定容。 5.3.3缓冲液C，pH 3.50。 准确称取四水柠檬酸三锂18.8 g，氯化锂50.9 g，溶于500 mL水中，后加入10 mL 32 %(质量分数)盐酸溶液，转移至1000mL容量瓶中，用水进行定容。 钾钠缓冲液，pH 5.51。 5.4 准确称取三水乙酸钠272.0g，醋酸钾196.0 g，溶于200 mL乙酸(99%,100%(质量分数)中，转移至1000mL容量瓶中，用水进行定容。 2)5.5 茚三酮溶液 准确称取茚三酮20.0 g，苯酚2.0 g，溶于600 mL甲醇中，转移至1000mL容量瓶中，用钾钠缓冲液(5.4)定容至刻度。此溶液应现配现用。 5.6 还原剂 每1000 mL茚三酮溶液(5.5)中加入0.2 g抗坏血酸。 5.7 混合氨基酸标准储备液 1)锂离子缓冲溶液的配制方法为推荐性的，操作者可根据所使用仪器的情况自行调整。 2)茚三酮溶液的配制方法为推荐性的，操作者可根据使用仪器的情况自行调整。 本标准中所规定的21种氨基酸的浓度均为1.0 mol/mL。 3)5.8 混合氨基酸标准工作溶液 分别移取一定量的混合氨基酸标准储备液(5.7)，用样品稀释液(5.2)配制成各氨基酸浓度均为5 nmol/mL、20 nmol/mL、50 nmol/mL、100 nmol/mL、200 nmol/mL的系列混合氨基酸标准工作溶液。该标准工作溶液在4?冰箱内可保存3个月。 6 仪器 常用实验仪器以及下述各项。 6.1 旋风式样品磨:60目筛网。 6.2 分析天平:感量0.0001 g。 6.3 移液器:移液范围为50 L,200 L 和200 L,1000 L。 6.4 超声波振荡器:功率?60 W。 6.5 氨基酸分析仪(锂离子系统):同时具有自动进样，梯度洗脱，以及双通道紫外检测的功能。 6.6 高速离心机。 6.7 水相滤膜，0.45 m。 7 分析步骤 7.1 试样的制备 按照YC/T 31-1996中6.1的要求处理烟叶样品后，通过60目筛过滤制备试样，并按照YC/T31-1996中6.2的要求测定试样的水分含量。 7.2 测定次数 每个样品应平行测定两次。 7.3 样品分析 7.3.1 样品制备 称取约1 g试样(7.1)于100 mL磨口三角瓶中，精确至0.0001 g。准确加入盐酸溶液(5.1) 50 mL，塞上塞子，室温下超声萃取30 min。经离心后，取上清液，使用水相滤膜(6.7)过滤后上 机分析。 3)系列混合氨基酸标准工作液的浓度范围为推荐性的，操作者可根据操作习惯和所用仪器的灵敏度特点自行调整，要求至少制备5个工作标准溶液，且样品的浓度应在仪器的线性工作范围之内。 7.3.2 氨基酸分析仪分析 7.3.2.1 按照仪器说明书操作氨基酸分析仪。以下分析条件可供参考，采用其他条件应验证其适用性。 流动相A:缓冲液A(5.3.1); 流动相B:缓冲液B(5.3.2); 流动相C:缓冲液C(5.3.3); 分离柱初始温度:37 ?; 反应管温度:130 ?; 流动相流速:0.45 mL/min; 茚三酮溶液流速:0.25 mL/min; 进样体积:100 L; 检测器:双通道紫外检测器，570 nm和440 nm。 7.3.2.2 仪器梯度洗脱程序见表1。 表1 梯度洗脱程序 t/min 流动相A/% 流动相B/% 流动相C/% 0 100 0 0 11 100 0 0 12 79 21 0 34 79 21 0 46 42 58 0 61 20 80 0 64 0 100 0 69 0 0 100 122 0 0 100 7.3.3 样品测定 用氨基酸分析仪测定系列混合氨基酸标准工作溶液(5.8)，得到21种氨基酸的积分峰面积，用峰面积为纵坐标，氨基酸浓度(g/mL)为横坐标分别建立21种氨基酸的标准工作曲线，相关系数应不小于0.9995。测定烟叶萃取样品，根据样品中氨基酸的峰面积计算21种氨基酸的浓度。 混合氨基酸标准溶液和烟叶样品的参考色谱图参见附录B。 8 结果计算 按式(1)计算烟叶中21种游离氨基酸的含量。 (1) 式中: x样品中氨基酸的含量，单位为微克每毫克(g/mg); c样品溶液中氨基酸仪的测定浓度，单位为微克每毫升(g/mL); V萃取溶液的体积，单位为毫升(mL); m样品的质量，单位为毫克(mg); k稀释倍数; w试样的水分含量，%; 以两次测定的算术平均值作为测定结果，结果精确至0.001 g/mg。 9 精密度、回收率和检出限 本方法的精密度、回收率和检出限试验研究结果参见附录C。 10 检验报告 检验报告应包括以下内容: 识别被测样品需要的所有信息; 参照本标准所使用的试验方法; 检测结果，包括各单次测定结果及其平均值; 与本标准规定的分析步骤的差异; 检测日期; 检测人员。 附录A (资料性附录) 氨基酸分析仪管路图 氨基酸分析仪管路图见图A.1。 图A.1 氨基酸分析仪管路图 附录B(资料性附录) 氨基酸色谱图示例 B.1 570 nm处混合氨基酸标准溶液色谱图见图B.1。 图B.1 混合氨基酸标准溶液色谱图(570 nm) B.2 440 nm处混合氨基酸标准溶液色谱图见图B.2。 图B.2 混合氨基酸标准溶液色谱图(440 nm) B.3 570 nm处烟叶样品溶液色谱图见图B.3。 图B.3 烟叶样品溶液色谱图(570 nm) B.4 440 nm处烟叶样品溶液色谱图见图B.4。 图B.4 烟叶样品溶液色谱图(440 nm) 附录C (资料性附录) 精密度、回收率和检出限试验结果 本方法的精密度、回收率和检出限试验结果，见表C.1 表C.1 方法的精密度、回收率和检出限试验结果 回收率 定性限定量限氨基酸 重复性/% 加入量/g/mL /g/mL 加标浓度 回收率/% /mg/g 空白 0.266 98.42 Asp 中低浓度 0.075 99.21 4.99 0.023 0.077 中高浓度 0.205 101.46 空白 0.238 98.22 Thr 中低浓度 0.019 90.07 2.87 0.022 0.073 中高浓度 0.205 97.07 空白 0.210 98.01 Ser 中低浓度 0.043 91.65 3.64 0.016 0.053 中高浓度 0.095 90.03 空白 0.264 97.64 Asn 中低浓度 0.411 99.74 2.79 0.029 0.097 中高浓度 1.075 110.86 空白 0.294 98.55 Glu 中低浓度 0.059 88.06 6.18 0.048 0.160 中高浓度 0.168 96.31 空白 0.230 96.41 Pro 中低浓度 1.258 100.02 2.53 0.110 0.367 中高浓度 2.361 103.89 空白 0.150 97.24 Gly 中低浓度 0.021 87.25 6.84 0.010 0.033 中高浓度 0.168 86.64 空白 0.178 95.41 Ala 中低浓度 0.109 97.37 2.99 0.011 0.037 中高浓度 0.244 99.59 空白 0.234 99.87 Val 中低浓度 0.065 91.08 3.63 0.025 0.083 中高浓度 0.136 94.12 表C.1(续) 回收率 定性限定量限氨基酸 重复性/% /g/mL /g/mL 加标浓度 加入量/mg/g 回收率/% 空白 0.481 100.29 Cys 中低浓度 0.039 90.98 6.14 0.033 0.110 中高浓度 0.118 94.92 空白 0.262 99.11 Ile 中低浓度 0.030 83.17 6.38 0.020 0.067 中高浓度 0.070 84.86 空白 0.262 99.11 Leu 中低浓度 0.069 86.22 3.55 0.019 0.063 中高浓度 0.175 85.79 空白 0.362 95.48 Tyr 中低浓度 0.038 101.44 5.34 0.048 0.160 中高浓度 0.095 98.06 空白 0.330 96.25 Phe 中低浓度 0.081 92.04 3.59 0.061 0.203 中高浓度 0.155 95.32 空白 0.178 97.65 -Ala 中低浓度 0.035 85.33 5.38 0.026 0.087 中高浓度 0.080 85.10 -Aia 空白 0.206 97.94 2.96 0.021 0.070 中低浓度 0.105 97.53 中高浓度 0.315 100.00 空白 0.206 97.94 -Aba 中低浓度 0.041 89.64 2.32 0.076 0.253 中高浓度 0.070 88.97 空白 0