病原生物检验的要求.doc

第二章 病原生物学检验的基本要求第一节 实验室条件和基本要求 实验室设计和建造应符合国家环境保护和建设主管部门等的规定和要求。实验室防火和安全通道设置应符合国家的消防规定和要求，同时应考虑生物安全的特殊要求。实验室的设计应保证对生物、化学、辐射和物理等危险源的防护水平控制在经过评估的可接受程度，为关联的办公区和邻近的公共空间提供安全的工作环境，及防止危害环境。病原生物学检验实验室的入口处应有警示和进入限制。应评估生物材料、样本、药品、化学品和机密资料等被误用、被偷盗和被不正当使用的风险，并采取相应的物理防范措施。应有专门设计以确保存储、转运、收集、处理和处置危险物料的安全。实验室内温度、湿度、照度、噪声和洁净度等室内环境参数应符合工作要求和卫生等相关要求。进行微生物检验的实验室，为了防止交叉污染，保护工作人员健康，实验室应至少划分成三个区。 一、清洁区包括办公室、休息室、培养基配制室、试剂储藏室。此区域禁止带入细菌检验标本。 二、操作区 1整洁：微生物操作区是各种病原菌相对集中的地方，为了减少粉尘流动， 防止交叉污染，操作区应与外界分开。实验室工作人员进入操作区换鞋，送标本人员不进入操作区，操作区地面用专用拖把每天拖一次，每周用消毒剂擦洗一次。每天早上工作前，用紫外灯照射30min，对整个操作区进行消毒，下午工作结束后用消毒液消毒工作台面。保证工作环境的安全整洁。 2光线：细菌培养的细小菌落及血清试验凝集颗粒观察，都需要有充足的光线。操作室除设置常规照明灯外，还必须安装操作台灯，保证实验结果的正确判断。 3通风：由于各种病原菌集中，空气污浊，实验室要求保持良好的自然通风，必要时应配备抽风机。 4温度和湿度：由于无菌操作的要求，实验过程中经常使用酒精灯，因此，微生物实验室不能安装吊扇，为了达到实验所需的适宜温度，尤其是某些仪器对温度湿度的要求，实验室应安装空调。5电源：实验室应该要求提供稳压、恒频的电源，根据仪器设备要求，必要时配备不间断电源。6水源：实验室的操作区内须设置水源，用于标本处理（如细菌染色）的水槽与工作人员洗手用的水槽不能混用。7污染物处理：实验室操作区须备有消毒缸,以处理沾有活菌的玻片等污染物品。检验剩余的标本及微生物使用过的平板、试管均须集中地点放置，经消毒灭菌处理后再洗涤或丢弃。 三、无菌区 1、 无菌室应完全封闭。2、进出无菌室至少要经两道门，中间隔有缓冲间。3、无菌室与外间设置一个可开闭的窗口，用于传递器具。无菌室必须保持整洁。4、工作人员进入无菌室应换专用鞋、专用衣。5、无菌室使用前须用紫外线消毒30min，操作结束后清洁台面，再用紫外线消毒30min。6、定期用乳酸或甲醛熏蒸，彻底消毒。7、无菌室仅用于培养基分装等无菌操作，不能进行有菌标本的操作。8、操作人员操作时应严格关门，并戴好专用的口罩、帽子。9、无菌室内应有空气过滤装置，并安装空调。四、实验室安全操作的基本要求作为一个预防医学工作者应该充分认识和理解所从事工作的风险。自觉遵守实验室管理规定和要求。在身体状态许可的情况下，接受实验室的免疫计划和其他健康管理规定。按规定正确使用设施、设备和个人防护装备。主动报告可能不适于从事特定任务的个人状态。如果怀疑个人感染，应立即报告。不因人事、经济等任何压力违反管理规定。有责任和义务避免因个人原因造成生物安全事件或事故。主动识别任何危险和不符合规定的工作，并立即报告。1、所有处理血液、体液或其他可能具有传染性的物质（包括接触病人的黏膜或有损伤的皮肤、或在处理污染的物品或表面时）的工作人员都应戴手套，如果有可能发生血液或体液的喷溅，或必须在生物安全柜外处理微生物时，则应使用面部防护装备。如果手套破损、刺破、或失去其屏障功能，则应尽快更换。一次性手套不得重复使用，在接触病员后应更换手套。不能戴着手套离开实验室或接触“洁净”设施表面（如键盘、电话、门柄等）。2、工作台面应铺垫一块具有吸收性能的材料，以防止液体滴落或溅落造成的感染性物质扩散，使用后按感染性废弃物处理。3、所有可能产生气溶胶或飞沫的操作都应在生物安全柜中进行。实验室应使用机械移液装置，绝对禁止用口吸移液。禁止用手直接处置注射器及其他锐器，以防止损伤；使用后或废弃的锐利物品都应放入专用容器内，并及时运走处理。4、实验中用过的污染物品在重复使用或装入容器中按传染性废弃物进行处理前，应先进行去污处理。被血液或其他体液污染的设备在进行维修之前应先进行清洁和消毒，无法彻底消毒的设备必须贴上生物危害警告标签。5、手或其他部位的皮肤在接触血液或其他体液后必须立即彻底清洗，在实验工作结束后或取下手套后应立即洗手；在离开实验室之前应脱下所有的个人防护装备。6、血液或其他体液发生泄漏或工作结束后，要及时用合适的化学杀菌剂对实验室工作区进行表面消毒。7、一般临床实验室应按BSL-2的要求。安全防护措施包括安全操作规范程序安全防范制度和废弃物处理制度等。第二节 实验人员要素与设备 一、人员要求在微生物检验中，几乎从标本处理到结果解释的每一步都需要高度的主观判断力和丰富的理论知识，提出微生物学评价。所以，要求每个技术人员都需要有丰富的实际操作经验和较强的主观判断能力，对实验技术人员的管理至少达到以下几点要求： 1每个工作人员必须经过临床微生物检验的专门基础教育和训练，并要求实验室工作人员在一定的时间内相对固定，不应随意变换。 2微生物检验是一个连续性极强的工作，必须在规定的时间内处理或判断结果才有意义，要求微生物实验室能够保证节假日也能进行必要且有效的工作。因此工作人员必须具备独立处理各类微生物检验标本的能力。 3工作人员必须通晓实验室操作规程并严格遵守。并经常阅读微生物方面的资料。尽可能多地参加学术会议和培训，了解微生物专业的新进展，并尽可能把新知识新理论应用到实际工作中。 4每位工作人员均应直接参与质量控制工作。实验室负责人定期或不定期地将已知结果的标本混入日常标本中考核工作人员的检验水平，提高质量意识。 5工作人员应加强与临床科室密切联系。可通过开展对临床医师的讲座，解答临床科室的咨询，参与临床查房等方式。以促进微生物检验的质量的提高。二、基本设备和要求 保持仪器设备的良好工作状态是实验室保证工作质量的重要一环。微生物实验室基本的设备有孵箱、冰箱、水浴箱、高压灭菌器、二氧化碳培养设备、厌氧箱培养设备、天平、pH计、显微镜、玻璃器皿、接种器具、离心机等。每一台精密仪器均应有专人负责，定期维修和保养，并建立详细的档案记录，记录应该包括以下内容：仪器设备名称、仪器型号、生产厂家的名称和地址、仪器编号、购置日期及使用日期、保修期、电源要求、操作手册、使用记录、故障出现及维修记录等，以保证仪器正常运转。三、实验室基本设备的质控要求 1孵箱 根据需要设置温度，可调温度范围应由室温至60。孵箱温度允许的波动幅度为设置温度1，如一般细菌培养，孵箱温度应为351。应每天记录孵箱温度，定期加水，每月清洁内壁和架子。2冰箱、低温冰箱普通冰箱允许温度为42，每天记录温度，并定期清洁。尽量减少冰箱开启次数，减少温度的波动。低温冰箱控制温度-205，每天观察温度并记录，每隔三个月除霜一次。一旦温度失控，及时调整。3水浴箱 水浴箱根据需要设置温度，温度允许的波动幅度为设置温度0.5，每日检查水位，记录温度。每月擦拭内部并换水。4高压灭菌器 高压灭菌器控制温度121，每次使用前观察并调整水位，记录使用时间，温度或压力。每周用嗜热芽胞杆菌检测灭菌效果，每月清理内部及换水，并定期检测密封圈的密封效果。 5二氧化碳培养设备 常用的有二氧化碳箱和蜡烛罐，要求CO2浓度为5%-10%，箱内或罐内保持湿度，并用淋病奈瑟菌作效果监测。6厌氧培养设备 主要有厌氧箱、厌氧罐、厌氧袋。混合气体组分要求CO2 10%、 H2 10%、N2 80%。厌氧箱、厌氧罐要每周清洁内部，定期更换催化剂。每次使用培养设备都应用美兰指示剂或铜绿假单胞菌检测厌氧效果。7天平 实验室用天平要保持光滑、清洁，并定期进行自校或定期外校，保证其处于最佳状态。将天平置于稳定的工作台上避免振动、气流及阳光照射。在使用前调整水平仪气泡至中间位置。电子天平应按说明书的要求进行预热。称量易挥发和具有腐蚀性的物品时，要盛放在密闭的容器中，以免腐蚀和损坏电子天平。 8pH计 一般pH计要求精度达0.02，并定期校正。9显微镜 实验室最常用的是光学显微镜，应注意保护油镜。每次使用后，应用擦镜纸擦去油镜头上的镜油。每天工作结束后，应用含少量二甲苯的擦镜纸擦拭油镜，再用洁净擦镜纸擦干。另外还用到暗视野显微镜、荧光显微镜等，均应按程序清洁和保养。10玻璃器皿 微生物实验室所用试管、吸管、平板等应洁净无菌，不残留酸碱。11接种器具分为接种针和接种环两种。应选用传热散热快，耐用，不生锈的材料，早先使用的白金丝由于价格昂贵，目前多用比较经济的镍铬丝代替。一般要求接种环长5cm-8cm，环直径2mm-4mm，定量接种环要定期校正其容量，接种针长5cm-8cm。表1-1 仪器设备质量控制要求 设备 控制标准 保养及监测高压灭菌器 121 每次用前换水，每月清洁一次孵育箱 351 每天记录温度；每月清洁内壁和隔板水温箱 370.5 每周第一天记录温度；每月檫内壁和换水冰箱 42 每周第一天记录温度；保持清洁并定期除霜低温冰箱 205 每周第一天记录温度；保持清洁并除霜 二氧化碳培养箱 5%-10% 每天记录温度；换水；淋病奈瑟菌监测效果厌氧培养箱 10% H2、10% CO2、80% N2 每次使用时用厌氧指示剂监测效果第三节 实验室安全措施和质量保证一、实验室安全措施 1实验室工作人员要认真学习、严格执行实验室安全制度，并定期检查。 2进入实验室要穿操作服，工作服应放置在指定的地点，并经常消毒洗涤；生活用品不能带入实验室，必要的书籍带入后要和操作面远离，带离实验室前必须经消毒处理。 3实验室内不得高声谈笑，不准吸烟、饮食，不要用手触摸头、面等部位以免造成污染。如有传染物污染手部，要立即用2%-3%来苏尔或0.3%过氧乙酸溶液浸泡，再用肥皂水和流水冲洗干净。如有传染物吸入口中，应立即吐出，再用大量清水漱口，并根据需要服用相应的药物以防感染。 4如有传染物污染桌面或地面应立即用2%-3%来苏尔或5%石碳酸溶液覆盖其上，经30min后方可抹去。如工作服被病原微生物污染，应立即脱下，进行高压灭菌处理。 5实验室应用紫外线进行空气消毒，并定期检测；接种环（针）使用后应立即在火焰灯上烧灼灭菌；沾有活菌的玻片、吸管等物品应立即浸泡在盛有消毒液的消毒缸内。检验剩余的标本及微生物使用过的平板、试管均须集中地点放置，经消毒灭菌处理后再洗涤或丢弃。 6实验动物应严格管理，不得让其逃离笼子，实验动物尸体应焚烧处理。7各种电器设备，如电炉、烤箱等，要专人保管，并有使用记录；易燃物品（如酒精、乙醚等）应妥善保存，远离火源，若出现着火情况，应立即用湿布或沙土将其覆盖。8易燃、易爆、剧毒化学物品应有专人保管并有使用记录；分离出甲类或乙类传染病菌株，应及时上报有关部门，未经上级同意，不得带出实验室或擅自处理；菌种保存必须专人负责，并建立保存菌种档案和菌种使用、收发记录。9工作结束后，要用消毒液消毒工作台面；工作人员应将双手用消毒液浸泡后，再用肥皂、流水清洗干净；检查好水源、电源后，方可离开实验室。10.微生物实验室工作人员应定期进行健康体检及必要的预防接种，以增强自身抵抗力。二、实验室质量保证 质量保证是指实验室为了达到应有的质量标准而采取的措施。微生物检验的质量保证与其他检验相似，但也有其不同的特点，可以用以下几个标准来衡量： 1可靠性 如为定量试验，即指测定值与真实值的接近程度，如血清抗体滴度测定，抗菌药物最低抑菌浓度检测；如为定性试验，则观察测定值是否正确，如病原菌的鉴定、K-B纸片法测抗菌药物敏感试验结果。 2可重复性 指同一标本用同一方法检测获得的结果之间重复程度。微生物检验由于下面两方面的原因，而影响可重复性和精确性。一是缺乏同种性，即同一位病人的同一个标本中可含有不仅一种微生物，重复培养会分离到不同的微生物。二是缺乏稳定性，指随着时间变化，一个标本中的微生物以不同速度繁殖或死亡，重复培养会分离到不同的微生物，因此，要求标本的送检、处理、结果判断都要有一个统一的标准。 3临床效果 指所做的试验正确诊断某种致病菌或某种致病条件的能力。常用敏感性和特异性表示。理想的试验应该是敏感性高，特异性好。在微生物检验中，往往要结合几个方面来诊断某种疾病，如单用麦康凯培养基分离粪便中的沙门菌，就缺乏敏感性，因为肠道非致病菌过度生长而掩盖致病菌；同样，单纯靠肥达反应结果诊断伤寒，则缺乏特异性，因为既往感染和其它非特异性感染存在有交叉凝集反应。4及时性 临床微生物检验结果如果不能及时报告，就算准确性最高，病人也会因失去最佳治疗时机而起不到作用。试验结果能否及时提供医生作诊治病人之用，在临床微生物检验中尤为重要。要求实验室在建立准确性试验的基础上选择一些适应临床需要的快速试验。并实行培养标本的分级报告制度。三、质量保证的两种类型1室内质控 包括对实验质量的连续监测和对各个实验步骤的全面检查。微生物检验质量要达到可靠、及时、重复性好、临床效果佳的要求，就必须从技术人员培训；标本的采集、运送和接种；细菌的分离、鉴定；结果的解释与评价；菌种的保存与保管；药敏试验；仪器、培养基、试剂等多方面进行全面的质量管理。2室间评价 室间质评是在卫生部门领导下，由各级权威组织如检验中心负责组织的活动，包括对实验质量的定期检查和对鉴定试验、分离技术的定点检查。通过室间质评可以评价和比较实验室结果的可靠程度；发现和改正经常出现的错误；促进实验室使用标准的试剂和统一的操作程序；检验室内质控，促进室内质控的贯彻执行。第四节 微生物检验的质量控制 一、检验标本的质量控制 正确采集和处理标本是实验室取得正确结果的前提，目前仍有不少实验室和临床医护人员未能引起对检验标本分析前质量控制的足够重视，对标本采集方法和时间，标本来源，实验室人员虽然不能直接控制，但有责任指导医师、护士、病人及家属正确采集标本。可采取集中讲课、个别辅导和去病房作取标本示教等方式。此外影响检验质量的其他因素如检验标本的运送、储存与处理等，均应统一按正确的操作规程执行。二、标本鉴定的基本原则与药敏质控各类增菌、分离和生化反应培养基、抗血清、染色液和生化反应试剂等均应定期作质控测试。除口腔奈瑟菌等少数菌群外，细菌要鉴定到种。部分肠道感染菌要进一步分出血清型。微生物实验室在快速检出病原体的同时应提供准确的药敏试验结果，作为临床科学和准确的选择治疗用药的依据。试验方法包括纸片扩散法、琼脂稀释法、液体稀释法等。K-B纸片扩散法：此法WHO推荐使用水解酪蛋白琼脂（MH）培养基。要求琼脂平板厚度为4mm，pH7.30.1。含药纸片必须经过质量鉴定。纸片要求pH中性，直径为6.35mm，含药纸片应低温保存，-20最长不超过一年，常规使用可取出一周用量存放4冰箱。含药纸片应避免潮湿，盛纸片的容器自冰箱或冰冻箱取出后，必须置室温1-2h后再打开取出纸片使用，以避免冷凝水浸湿纸片。试验要求：药纸片与平板边缘至少相距15mm，纸片与纸片间中心点距离至少24mm。药纸片贴在琼脂上不得再移动，否则会因部分药已渗入琼脂而影响结果。从孵育18-24h的血平板培养物中，挑取4-5个菌落，制成0.5麦氏比浊浓度的菌悬液。用棉拭子沾取菌悬液在M-H平板上涂划，保证接种物均匀分布。接种菌液后，待琼脂表面水份干后，即按要求贴上药纸片，15min内放入35孵箱孵育，平板最好单独摆放，重叠最多不能超过两个。孵育18-24h，读取结果。用刻度尺或卡尺准确量取抑菌环直径。抑菌环直径以肉眼见不到细菌明显生长为限。判读试验结果，应参考NCCLS最新公布的折点表。用质控菌株按标准方法与临床标本分离菌株同步进行试验。更换药物或培养基时必须用相应质控菌株测试。 每次测试结果应作记录。如出现抑菌环直径超出可接受范围，应从培养基、抗菌药物、接种浓度等方面寻找原因，并及时纠正。选择合适的药物作药敏试验，可对临床的抗菌药物使用有提示作用。如金葡菌对苯唑西林耐药提示对目前所有-内酰胺类抗生素耐药，革兰阳性菌耐庆大霉素提示对氨基糖甙类耐药。克雷伯菌属及大肠埃希菌对头孢泊肟、头孢他啶或氨曲南耐药，提示菌株产ESBLs。选择感染部位有较高浓度的抗菌药物进行试验，有利于临床治疗。如尿路感染病人尿液标本中病原菌药敏试验可选用在泌尿道浓度较高的药物如硝基呋喃类呋喃妥因；中枢神经系统感染病人脑脊液中病原菌应选用能通过血脑屏障的药物如头孢呋辛。随着多重耐药菌株的不断出现，微生物实验室应根据临床要求和实际情况，开展一些特殊的药敏试验，如耐甲氧西林的葡萄球菌(MRSA)的检测，-内酰胺酶及超广谱-内酰胺酶(ESBLs)的检测，耐万古霉素肠球菌(VRE)的检测等。微生物学实验室应实行分级报告制度，将标本显微镜检查的初级结果报告临床科室，并进行初级药敏试验，为临床早期治疗提供依据。实验室要有完善的实验结果登记制度和原始记录，包括临床资料，细菌的分离、鉴定及药敏结果，培养基和试剂的配制记录。以备病人检验报告单遗失或结果有疑问时查考。详细的结果记录，有利于定时统计、分析和总结医院感染菌的类型及耐药情况，及时通报医院感染菌控制科和临床科室，指导临床抗菌药物的使用和采购。三、培养基的质量控制 培养基是否合格对检验结果的正确与否起到关键作用。所有的培养基在临床使用前都必须经过无菌试验和性能测试，这既适用于实验室用基础物质配制的培养基，也适用于商品培养基。大多数商品培养基是脱水的，运输和储存及在冷热接触中会发生变化，尤其对易变质的培养基更应注重无菌状况和性能测试。脱水培养基一旦开封，应注明开封日期。所有脱水培养基应储存在阴凉干燥处，贮藏架不宜放在靠近高压灭菌器和水源的地方，以防潮湿和温度升高。培养基质量控制，应包括以下几个方面： (一)配制时的质量控制 1容器 配制和分装培养基的烧瓶、平皿或试管等器材应为中性，无酸、碱抑制物残留，药敏用平皿底部要平，以免琼脂厚薄不一，影响药敏试验结果。 2成分来源 各种成分来源可靠，不含对目的菌生长有抑制的物质。特殊要求的培养基，如葡萄糖氧化发酵(O-F试验)，除加入葡萄糖外，不能含有其他糖类，指示剂不能用酒精溶液，避免O-F试验的假阳性。培养基配制用水应是不含杂质的蒸馏水。 3pH调整 根据培养基的不同要求调整pH值，控制在要求范围的0.2之内。应当注意，培养基在高压灭菌后其pH值降低0.1-0.2，故矫正时应比实际需要pH高0.1-0.2。 4灭菌 根据培养基所含成份及配制数量的不同，选择不同的灭菌方式，既要达到灭菌效果，又不破坏培养基成份。一般对稳定的培养基，如MH琼脂，营养琼脂可用高压灭菌，即121 15min，而含糖的培养基则以108灭菌为好，以防止糖类破坏。不耐高热的物质如血清，牛乳等，可采用间隙灭菌法。 5分装 根据使用的目的和要求决定分装量。分装培养基所用的平皿、试管要求清洁，不残留酸碱，制备平板培养基时，操作台要水平，以避免琼脂平板厚薄不一，同时确保无菌操作。 ( 二 )配制后质量控制1培养基外观情况 包括颜色，透明度，有无沉淀和凝固。如发现培养基表面有裂纹或与培养皿的边缘分离，说明培养基有脱水现象，必须丢弃。 2无菌试验 每一批配好的培养基均须进行无菌试验。先灭菌后分装的培养基，可采用抽样方法试验，少于100个样本通常选取5-10的量，如果配制大量培养基，则任意选取10个培养基；无菌分装培养基则需全部做无菌试验。样本在35或其他适宜的温度下隔夜培养，如培养基含有血液，则需再置于室温一天，以检查嗜冷菌。选择性培养基因含有抑制物质，能抑制许多微生物，因此，可加入10倍量的无菌液体培养基，稀释抑制物质，可检出污染菌。即使做过无菌试验，接种时，也要检查每个平板上的可见菌落。 3性能测试 每一批新制或新购的培养基，使用前均须取已知性质的库存菌种进行性能测试。培养基按目的不同可分为增菌培养基、分离培养基和鉴定培养基。增菌培养基应接种少量难以