等温滴定量热法.docx

等温滴定量热法(ITC)的简易操作流程： 样品的准备，包括滴定物与被滴定物(如DNA滴定蛋白质)。a. 实验前的蛋白质样品需用缓冲溶液透析(注意透析袋的正确使用)，透析时间一般为24小时，buffer体积为1L，且中途注意更换buffer，其目的是为了减少由于溶液组成不同而产生的滴定误差；b. 样品的浓度要求，一般要求的浓度为微摩尔级，且滴定物(DNA)的浓度是被滴定物(蛋白质)的十倍左右为宜，且实验前需要再次确认所配样品的浓度是否符合要求；c. 在进行滴定实验前，用于空白对照的缓冲液，蛋白样品以及DNA均需抽真空除气泡(15Mins左右为宜)。 仪器的清洗。a. 在进行真空除气泡前，除气泡用容器均需用超纯水清洗三次左右，且清洗完毕后擦干内壁，防止由于残留缓冲液的稀释而导致样品浓度的改变；b. 样品池(sample cell)的清洗，用超纯水清洗15次左右(每次2ml左右)，清洗完毕后，一定要将残留的超纯水吸干净；c. 注射器(syringe)的清洗，用超纯水清洗3次以上(专用注射器清洗,此时无需点击open,close和purge选项)，清洗完毕后将注射器的头部擦干，之后清洗装DNA的小试管，步骤同注射器的清洗。 设置空白对照试验（DNA滴定缓冲液），将缓冲液置于小试管中(为了防止空气的进入，一般添加样品的量大于其实际所需的量)，打开控制界面，点击open之后，用手动注射器缓慢拉动活塞，此时注射器管中的液面上升，然后点击close, 注射器会自动将小试管中的缓冲液吸入注射器中，当缓冲液完全吸入注射器之后点击pump键，除去气泡；在清洗样品池的同时就设置所需的实验温度（套管温度，一般较反应温度稍低），并输入样品的实际浓度以及实验数据文件名和储存路径等一系列参数（如注射时间，注射次数，注射间隔时间）。 设置滴定实验，步骤同空白试验，只需将样品池中用于空白对照的缓冲液换成蛋白样品同时修改文件名(先准备样品池中的样品，后准备注射器中的样品)。 试验结束后需依次使用缓冲液和超纯水清洗样品池、注射器、小试管等所有使用容器。 实验数据的处理和拟合模型的选择，根据所得数据选择适当的参考模型后进行曲线拟合来得到我们预先设想的结果。附：一、样品浓度的确定，以DNA滴定蛋白质为例P=2.25mg/ml/9500g/mol=0.237mmol/L验证DNA的用量 开始时测得的蛋白质浓度PVp/DVd=1/2.5=0.237mmol/L1.4ml/D0.28ml D=2.96mmol/L假设每一次使用一整管DNA(使用前离心)，则有D=384.13nmol/1mol=384.1umol/L 避免因buffer的加入而导致体系的改变DNA标注的物质的量 PVp/DVd=1/1.5=P1.4ml/384.1ummol/L0.28ml P=0.0307mmol/L 保证DNA的经验所得 用量足够 蛋白质的稀释过程：n(稀释前)=n(稀释后) 即P1V=P2V2 实际准备的蛋白样体积为2.5ml 0.237mmol/LV1=0.0307mmol/L2.5ml V1=0.324ml则需要加入的buffer的体积为V=2.5ml-0.324ml=2.176ml,因此取0.324ml稀释前的蛋白样品后加入2.176ml的buffer即可待上述过程完毕过后，进行实验之前需再次分别测定蛋白质样品和DNA的浓度，后测得:P实际=0.0273mmol/L D实际=492ng/ul/1718g/mol=0.2864mmol/L则实际计算得：PVp/DVd=0.0273mmol/L1.4ml/0.28640.28ml=1/2.1 两者的实际比值在接受范围之内二、实际控制界面 磁石 样品放置位置 真空除气泡装置温度显示屏(一般设置为20)1.在桌面点击VPViewer2000之后会弹出如下界面2.在ITCcontrols中输入反应物的浓度 输入DNA实际浓度 输入蛋白质实际浓度更改文件名称3.在thermostat/Calib中设置夹套温度(最好在清洗样品池的同时就设置，避免因降温缓慢而等待)。 设置夹套温度