实验二、离心技术及物质代谢实验.docx

实验二、离心技术及物质代谢实验一、离心技术【概念】 根据物质沉降系数、质量、浮力因素等的不同，应用离心力使物质分离、浓缩、提纯的方法。【应用】分离、提纯、鉴别生物高分子；分离线粒体、染色体、微粒体、溶酶体等亚细胞物质。【基本原理】1、离心力 ， ， FF：粒子在离心场中所受的离心力a：粒子旋转的加速度m：沉降粒子的有效质量：粒子旋转的角速度r：粒子的旋转半径(cm)2、相对离心力相对离心力：离心力相对于重力的倍数，单位是gRCF(relativecentrifugalforce) ：相对离心力rpm( revolutions per minute ) ：每分钟转速低速离心时常以转速“rpm”来表示 高速离心时则以“g”表示3、沉降系数(S) 物质在单位离心力场下的沉降速度。单位：Svedberg，1S=10-13s 另外，对某些生物高分子或亚细胞器组分的化学结构、分子量尚不了解时，可用沉降系数对其物理特性进行初步描述，将其区别开来，如原核生物的核蛋白体RNA（rRNA）分为5S、16S、23S，即是根据其在离心场中的行为来进行分类。【离心机的类型和主要构造】 1、类型普通离心机： 6000rpm 高速离心机： 600020000rpm 超速离心机：20000rpm 工业用离心机离心机 制备性离心机 实验用离心机 分析性离心机 2、主要构造转头，离心管和管帽，制冷系统，真空系统，制动装置，指示表盘【离心操作的注意事项】 1、使用各种离心机时，必须事先在天平上精密地平衡离心管和其内容物，转头中绝对不能装载单数的管子，当转头只是部分装载时，管子必须互相对称地放在转头中，以便使负载均匀地分布在转头的周围。 2、每个转头各有其最高允许转速和使用累计期限，使用转头时要查阅说明书，不得过速使用。3、装载溶液时，要根据各种离心机的具体操作说明进行，根据待离心液体的性质及体积选用适合的离心管，有的离心管无盖，液体不得装得过多，以防离心时甩出，造成转头不平衡、生锈或被腐蚀;而制备性超速离心机的离心管，则常常要求必须将液体装满，以免离心时塑料离心管的上部凹陷变形。4、若要在低于室温的温度下离心时。转头在使用前应放置在冰箱或置于离心机的转头室内预冷。 5、离心过程中不得随意离开二、物质代谢实验【胰岛素对血糖含量的影响及测定】 1、实验目的 （1）通过实验方法证实胰岛素对血糖含量的降低作用， 即检测家兔 注射胰岛素前后血糖浓度的改变。 （2）掌握邻甲苯胺法测定血糖浓度的方法。 2、实验原理（1）胰岛素降血糖的机理促进肌肉、脂肪组织对葡萄糖的通透性，促进葡萄糖进入这些细胞； 糖原合成,糖原分解；糖有氧氧化；磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶合成糖异生；激素敏感性脂肪酶脂肪动员。蓝绿色化合物（630nm）羟甲基呋喃甲醛（羟甲基糠醛）邻甲苯胺浓酸溶液 （含有硼酸的冰醋酸）水浴加热至100，脱水形成葡萄糖（2）血糖测定（邻甲苯胺法）3、实验方法（1）胰岛素对血糖含量的影响：家兔注射胰岛素前后血糖含量的变化。取饥饿12小时家兔一只，记录体重采取血标本：用二甲苯棉球涂擦家兔耳部，使局部血管扩张，然后用刀片纵行切开边缘耳静脉，让血液自然滴入试管中，收集约2ml，待血凝固后，分离血清（3000rpm, 5min,离心后转移上清至一新离心管)按家兔体重，腹腔注射1.5单位kg胰岛素，记录注射时间，待40分钟后，用同样方法取血，分离血清将注射胰岛素前后的血清，分别测定血糖含量。 注意事项（a）家兔已经饥饿12小时，在采血和注射胰岛素时动作尽量温和。 （b）取耳缘静脉要用刀片纵向割开，从尖部到根部 （c）首次接触使用离心机，离心机使用时一定要配平，并对称放置。受离心机内空间限制，取血要用短试管。 （d）试管一定做好标记。（2）血糖含量的测定取长试管四支，按下表操作试剂（ml） 测定管（前）测定管（后)标准管空白管血清（前）0.1血清（后）0.1糖标准0.1蒸馏水0.1邻甲苯胺试剂4.04.04.04.0混匀，置沸水浴中加热10分钟，取出立即置冷水中冷却用630nm波长，以空白管校正吸光度为0，分别测定各管吸光度值标准液：0.490注射前：0.641注射后：0.319计算（测定管吸光度/标准管吸光度）*标准液浓度*100=血糖（mg/100ml）注射前：130.81mg/100ml注射后：65.10mg/100ml标准液：葡萄糖标准液 0.1 mg/ml正常参考范围 3.96.1mmol/L （人） 130mg/100ml （兔）【糖酵解中间产物的鉴定】1、实验目的 检测糖酵解中间产物磷酸丙糖的生成。2、实验原理酵母液：含有葡萄糖及糖酵解的全部酶pH7.4磷酸盐缓冲液：提供适宜的pH，必要的金属离子等CCL3COOH：强酸，使糖酵解的全部酶失活一碘醋酸：与3-磷酸甘油醛脱氢酶的-SH（必需基团）起反应，使3-磷酸甘油醛脱氢酶失活。 酶-SH+ICH2COOH酶S-CH2COOH+HI硫酸肼：磷酸丙糖稳定剂，保护磷酸丙糖不致自发分解，使其不能向其他方向变化。2，4二硝基苯肼：与丙糖反应生成相应的苯腙，后者在碱性溶液中溶解呈紫红色，可借此鉴定丙糖之生成。2、实验方法（1）取试管3支，编号，按下表进行操作（2）记录三管所发生的情况，并加以简要的分析试剂123pH7.4磷酸盐缓冲液2.02.02.0一碘醋酸0.50.5硫酸肼0.50.510CCL3COOH1.0酵母液4.04.04.0水1.02.0混匀，在3738恒温水浴中保温30分钟一碘醋酸0.5硫酸肼0.510CCL3COOH1.01.0水2.01.0混匀，静置10分钟，离心,3000转/min,10分钟，再取三支试管，对号按下表操作上清液0.50.50.51mol/L NaOH0.50.50.5混匀，在室温放置10分钟2，4二硝基苯肼0.50.50.51mol/L NaOH3.53.53.53、实验结果4、注意事项成腙反应前，溶液必须先碱化并在室温放置10min，目的是使磷酸丙糖中的磷酸基水解脱去，生成的颜色比较稳定；一碘醋酸和三氯乙酸是酶的抑制剂 ，使用移液管后必须彻底清洗移液管，否则易导致实验失败。【血清胆固醇测定（酶法）】 1、实验目的 （1）了解胆固醇氧化酶法测定血清胆固醇的原理。 （2）掌握血清胆固醇测定的临床意义。 2、实验原理血清中总胆固醇包括胆固醇酯(CE, 70%)和游离型胆固醇(FC, 30%)。胆固醇酯酶（CEH）先将胆固醇酯水解为胆固醇和游离脂肪酸（FFA），胆固醇在胆固醇氧化酶（COD）的作用下氧化生成4-胆甾烯酮和过氧化氢。后者经过氧化物酶（POD）催化与4-氨基安替比林（4-AAP）和酚反应，生成红色的醌亚胺，其颜色深浅与胆固醇的含量呈正比，在500nm波长处测定吸光度，与标准管比较可计算出血清胆固醇的含量。反应式如下：3、实验方法（1）标本：不溶血的血清或血浆标本。血浆用肝素钠、EDTA抗凝，不可用草酸盐、氟化物。（2）取试管3支，编号，按下表操作。加入物（ul）测定管标准管空白管血清10胆固醇标准液10蒸馏水10酶应用液100010001000混匀后，37水浴保温15分钟，在500nm波长处比色，以空