c-Myc标签Co-IP试剂盒中文说明.doc

23620描述ProFound c-Myc Tag IP/Co-IP Kit 包含了足够25个与c-Myc 标签蛋白IP或Co-IP的成分，包括10个c-Myc 标签阳性对照的实验 试剂盒成分：Immobilized Anti-c-Myc, 62.5 g固定的珠状琼脂加上125g 抗体，以含25%的溶液和0.1%叠氮钠的PBS的形式提供(总体积为250ul)。BupH Tris Buffered Saline Pack, 一个包装，用500 ml超纯水稀释后，溶液成分为25 mM Tris, 0.15 M NaCl, pH 7.2Elution Buffer, 50 ml, pH 2.8 Lane Marker Non-Reducing Sample Buffer (5X), 5 ml, 包含0.3 M TrisHCl, pH 6.8, 5% SDS, 50% 甘油, 电泳指示剂。 Handee Spin Columns Accessory Pack, 含提前放置好的玻璃原料，顶盖和底盖的27Collection Tubes and Caps Accessory Pack, 100 有刻度的2 ml 管子和塞盖 c-Myc-tagged Positive Control, 500ul，1 mg/ml E. coli 提取的包含c-Myc-标签GST（古胱氨酸S-转移酶）储藏: 收到后，将c-Myc-标签阳性对照放在-80度冰箱，（在-20度可放6个月），将其他所用到的成分放在4度，c-Myc-标签阳性对照用干冰运输。注意： ProFound c-Myc Tag IP/Co-IP Kit是ProFound c-Myc Tag IP/Co-IP Application Set (23622) 和 c-Myc-tagged Positive Control (23633)的联合体。介绍ProFound c-Myc Tag IP/Co-IP Kit与用蛋白A/G琼脂糖的IP方法相比，传统的提供了一个简单快速的方法来研究c-Myc-标签蛋白。高亲和性的抗c-Myc抗体相连的琼脂糖使得c-Myc标签蛋白和其相互作用的不含抗体的成分的IP和Co-IP。Handee离心管能使其产物带有小体积的固定抗c-Myc(抗c-Myc琼脂糖)，并能够在整个过程中作为一个单独的离心管，防止在洗脱的时候抗c-Myc琼脂糖的损失。Handee离心管通过有效的分离Buffer，进一步加强了从抗c-Myc琼脂糖的回收率。抗原表位标记使得其识别标签特异性的融合蛋白而不是蛋白特异性抗体。抗原表位标记蛋白的IP能用来确定的蛋白细胞定位，并研究翻译后的修饰或检测标记蛋白质和其他蛋白质之间的相互作用。c - myc标签由源自人类c - myc蛋白C端的十个氨基酸(EQKLISEEDL)组成。c-Myc标签蛋白的IP是用抗c-Myc标签抗体来识别来自于天然蛋白的表达蛋白。ProFound c-Myc-Tag IP/Co-IP Kit用了高亲和力的抗c-Myc标签抗体使得标签蛋白的分离和鉴定不受其表达水平的限制。抗体和琼脂糖之间的共价连接导致了IP产物免受抗体的污染。c-Myc标签阳性对照用来验证IP和抗c-Myc标签琼脂糖。Handee离心管有利于在IP/Co-IP过程中c-Myc标签琼脂糖的完全保留，并使因为c-Myc标签琼脂糖损失造成的实验误差达到最小（请看附录中与试剂盒相关的离心管图标和数据）。步骤简介重要的产品信息为了得到最好的结果，在尝试IP之前，需要确定含c-Myc标签融合蛋白表达的合适实验条件。试剂盒提供的buffer使得有足够的灵活度来确定分离相互作用蛋白的最适条件。相互作用蛋白的特点可能需要改变结合和洗脱buffer。蛋白共因子，二价阳离子，洗涤剂或附加的盐离子可能会用到。用一个非转染的细胞裂解液作为阴性对照来确定c-Myc标签琼脂糖的非特异性连接蛋白。c-Myc标签阳性对照（c-Myc-tag IP/Co-IP 试剂盒提供的）用来验证抗c-Myc标签琼脂糖是否能够成功的结合c-Myc标签蛋白。为了获得c-Myc标签蛋白的最好结果，在准备所有裂解液时候，添加蛋白酶抑制剂(Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-Free, Product No. 78415)。所需要的另外的材料Microcentrifuge capable of 16,000 g Protease inhibitors (Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-Free, Product No. 78415) Tween-20 (Surfact-Amps 20, Product No. 28320) End-over-end rocker or rotator Heat block 0.2 mm, 500 ml filter apparatus 1 M Tris, pH 9.5 1 M DTT (Product No. 20290) or 2-mercaptoethanol (Product No. 35602) 材料准备BupH Tris Buffered Saline Pack (TBS): 用500ml的无菌水重新稀释，用0.2um的滤器过滤后放在4度。最后的浓度是25 mM TrisHCl, 0.15 M NaCl; pH 7.2.Non-Reducing Sample Buffer (2X): 平衡泳道Mrker非还原性样本Buffer（5）至室温。上下颠倒5-10次，轻柔的混合样本Buffer。样本Buffer是粘稠的且可能需要枪头剪掉，这样才能慢慢地吸出溶液。加600ul的无菌水到400ul的样品buffer中来稀释样品buffer。上下吸打混匀，藏于4度可超过一年。c-Myc标签蛋白的IP步骤A. Immunoprecipitation/Co-immunoprecipitation (IP/Co-IP) 注意：需要的细胞裂解液数量和孵育时间依赖于c-Myc标签蛋白的表达水平，且每一个特异系统都需要优化。Co-IP实验，buffer系统需要优化到保持蛋白与蛋白之间的相互作用。1将底部的塞子塞上Handee Spin Columns。加上适量的细胞裂解液到离心管。注意：为了获得很好表达的标签蛋白，从六孔板的量中获得用200ul细胞裂解液（400-600ug总蛋白）是最好的起始量（看图1）。离心管的最大体积是850ul。2. 用150ul TBS 稀释50ul c-Myc标签阳性对照，用来做阳性对照。3. 在分配之前迅速翻转小瓶几次来完全重悬抗c-Myc标签琼脂糖（不要涡旋），用宽口枪头将10ul抗c-Myc标签琼脂糖悬浊液（5ug抗c-Myc标签抗体）分配到每个标记的离心管中。拧紧盖子。4. 在4度上下翻转孵育混合至少1个小时，最佳的孵育时间从2个小时到过夜。5. 准备还有0.05% Tween-20 (TBS-T)洗脱缓冲液。每个离心管大约用3ml的洗脱液洗脱。6. 松开离心管的上盖，拔掉底部的塞子，将收集管放在离心管的底部，离心10s。丢掉液体（或者收集后用于将来的分析）。7. 加入0.5ml TBST 到每个管中。轻轻拧紧盖子并轻柔的翻转带收集管的离心管2-3次。离心10s。去掉洗脱液（或者收集后用于将来的分析）。重复该步骤两次。B. c-Myc标签蛋白的洗脱注意： 如果洗脱c-Myc标签蛋白将要被用来做功能应用，用洗脱方法1来洗脱蛋白。如果蛋白对低pH值敏感，用温和洗脱buffer（Product No. 21027）。对于电泳分析，用洗脱方法2.洗脱方法1：1. 将离心管放在一个新的收集管中，加入10ul洗脱buffer到抗c-Myc标签琼脂糖，轻松的盖上盖子，并温和的敲打管子以混合。离心10s。注意：这一步不需要塞上塞子在离心管中。2. 重复步骤1两次。三次洗脱液能重新利用并收集在收集管中。注意： 每20ul洗脱buffer加入1ul pH 9.5的1M Tris来快速中和洗脱液3. 为了还原性胶分析，加入10ul 1M DTT 或5ul 2-巯基乙醇到40ul的Lane Marker Non-Reducing Sample Buffer (5X)来准备还原性样本buffer。4. 加入7.5ul 上述描述的非还原性样本Buffer到30ul 洗脱样品中。95-100C加热5min。洗脱方法2：5. 将离心管放到新的收集管中。加入25ul 2非还原性样本buffer（由5的样品获得）到抗c-Myc标签琼脂糖，轻轻拧上盖子，并轻轻敲打管子以混匀。注意：这一步不需要塞上塞子在离心管中。6. 95-100C中加热装配的离心柱/收集管5mins。离心10s。注意：用非还原性样本buffer能最小的干扰来自共洗脱的抗体成分。7. 准备还原性SDS-PAGE的样本，每25ul样本中加入2-3ul 1 M DTT或1-2ul的2-ME。 注意：洗脱的c-Myc标签阳性对照可用银染来检测。更为敏感的检测方法例如Western blotting，将洗脱的c-Myc标签阳性对照稀释10或50倍（0.2-0.5ul 洗脱液已经足够分析了）。疑难解答问题原因解决方法很少或者没有c-Myc标签蛋白被检测到标签蛋白降解在细胞裂解液中加入蛋白酶抑制剂用新的细胞裂解液或者放在-80度的裂解液没有或者很少标签蛋白表达利用c-Myc标签阳性对照来用SDS-PAGE或Western blotting分析细胞裂解液增加IP/Co-IP的细胞用量敏感性检测系统用更加敏感的系统检测不能Co-IP相互作用蛋白对于比较弱的作用力来说洗脱条件太严格减少洗脱次数或降低洗脱液的离子强度相互作用蛋白表达量太低用更多的蛋白样品或者更敏感的检测系统采用了不合适蛋白与蛋白相互作用的buffer 优化Co-IPbuffer附录：A：Handee 离心柱的结构B： c-Myc标签E2EPF的IP图1 来自于哺乳动物细胞裂解液的c-Myc标签E2EPF的IP。人类胚胎肾脏细胞（293）用转染pCMV-c-Myc-E2EPF40h。细胞用含有蛋白抑制剂的M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent (200ul/六孔板)裂解，200ul细胞裂解液在4度分别与2，5, 10, 20ul（泳道3, 4, 5, 6）抗c-Myc标签琼脂糖孵育过夜。泳道1为阳性对照。c-Myc标签蛋白用25ul的非还原性样本buffer洗脱，10ul用于SDS-PAGE。用抗c-Myc标签抗体指示转至纤维素薄膜。ImmunoPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L), Peroxidase Conjugated (Product No. 31430; 1:100,000 dilution)作为二抗。膜用SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Product No. 34080)来孵育，并在X光下曝光。c-Myc-E2EPF的表达在同一块胶上泳道2上用15ul转染细胞液来鉴定。C 含c-Myc标签p53和 LTA (SV40 Large T-antigen)的Co-IP肿瘤抑制剂p53，与SV40大T抗原 (DNA 肿瘤病毒)形成一个复合体。这种联系增强了p53蛋白的稳定性，提出p53不能结合DNA，并诱导转录。抗c-Myc标签抗体能IP c-Myc标签的c-Myc标签（图2，泳道4）和Co-IP 有c-Myc标签p53的LTA。 没有与抗体（泳道5）和琼脂糖树脂（泳道6）的非特异性结合。图2：LTA和c-Myc标签p53的Co-IP。LTA和c-Myc标签p53在体内表达，35S-标签用含TNT的网状细胞裂解液。在IP和Co-IP之前，LTA和c-Myc标签p53 (Lane 3 & 6)（每5ul）c-Myc标签p53(Lane 4)，或LTA(Lane 5) 的细胞裂解液在30度孵育一小时，加入10ul抗c-Myc标签琼脂糖悬浊液(Lane 3, 4 and 5)或普通琼脂糖悬浊液(Lane 6)到所提到的样品中。IP和Co-IP在4度过夜。IP和Co-IP产物用25ul非还原性样品Buffer洗脱，用12% SDS-PAGE分离。用荧光法检测。Related Thermo Scientific Products 78415 Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-Free, 1 ml 24590 GelCode Blue Stain Reagent, colloidal coomassie protein stain for SDS-PAGE, 500 ml 24615 Imperial Protein Stain, coomassie protein stain for SDS-PAGE, 1 L 25612 SilverSNAPSilver Stain II, silver stain for SDS-PAGE, kit for 20 mini-gels 34080 SuperSignal West Pico Chemiluminescent Su