脉冲场凝胶电泳..doc

脉冲场凝胶电泳(PFGE实验原理、操作步骤和注意事项【实验原理】大分子DNA(一般长度超过20kb ，在某些情况下，超过40kb 在电场作用下通过孔径小于分子大小的凝胶时，将会改变无规卷曲的构象，沿电场方向伸直，与电场平行从而才能通过凝胶。此时，大分子通过凝胶的方式相同，迁移率无差别(也称“极限迁移率”，不能分离。脉冲场凝胶电泳技术解决了这一难题，它应用于分离纯化大小在102000kb 之间的DNA 片段。这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的，DNA 分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间显著地依赖于分子大小，DNA 越大，这种构象改变需要的时间越长，重新定向的时间也越长，于是在每个脉冲时间内可用于新方向泳动的时间越少，因而在凝胶中移动越慢。反之，较小的DNA 移动较快，于是不同大小的分子被成功分离。在许多实用的PFGE 方法中，倒转电场凝胶电泳是最简单最常用的方法(FIGE。通过把一个在不同电场方向有不同脉冲方式的脉冲电场加在样品上，倒转电场凝胶电泳(FIGE设备能把大小范围在102000kb 的DNA 片段分开。FIGE 也可通过重新确定一个对准完全固定好角度的电场，这样会进一步扩展其分离极限达到10Mb 。【仪器、材料与试剂】1. 制备DNA 样品所需材料1TEN 缓冲液(0.1mol/LTris，pH7.5；0.15mol/LNaCl；0.1mol/LEDTA。2Seaplaque 琼脂糖(EC 缓冲液中浓度为2%。3EC 缓冲液(6mol/LTris，pH7.5；lmol/L NaCl；0.5%Brij58；0.2% 脱氧胆酸盐(Deoxycholate；0.5%十二烷基肌氨酸钠(Sarcosyl。（生物秀实验频道 ）4ESP 缓冲液(0.5mol/L EDTA，1%十二烷基肌氨酸钠，lmg/mL 蛋白酶K 。5 溶葡萄球菌素(5mg/mL。6RNase(10mg/mL。7 胶模(由常规琼脂糖凝胶制得或购买成品 。8 苯甲基横酰氟(PMSF(17.4mg/mL 于乙醇中 。90.5g/mL 溴化乙锭2. 分离、纯化大的DNA 片段所需材料1 紫外递质。210mg/mL tRNA。35mol/L NaCl。4 苯酚/氯仿。53mol/L NaAc，pH5.2。695%乙醇。3. 设备1TBE 缓冲液。2Seakem HGT 琼脂糖。3Wide Mini-Sub Cell 凝胶电泳设备。4 变速泵或蠕动泵 (Bio-Red Laboratory。5IBI FIJI 600 HV 程序性开关设备。6 缓冲液冷却循环器 (Fotodyne ， New Britain ，WI 或Mini Chiller(Bio-Rad Laboratory 。【实验步骤】1. 脉冲电场凝胶电泳的DNA 样品的制备为避免大分子DNA 在提取过程中断裂，细胞需在琼脂糖凝胶块中进行原位裂解，在本实验中，我们使用金黄色葡萄球菌(StapHylococcusaureus 作为例子。1 取100mL 对数生长期金黄色葡萄球菌细胞于4，5000g 离心5min 。2 用20mL TEN 缓冲液冲洗沉淀，同样条件离心5min 。之后用10mL EC 缓冲液使细胞悬浮。3 取1.5mL 细胞样品与相同体积含2%SeaPLaque 琼脂糖的EC缓冲液迅速混合混匀并等分流溶液至封闭的模块中于4凝固，混合前加热至琼脂糖熔解并冷却至50。4 对于每一个菌株，需要1520 个凝胶块，将它们放至含有3045g/mL RNase(50mL 的10mg/mL 的RNase 的10mL EC缓冲液中，于37振摇过夜。5 去掉裂解缓冲液，换为10mL ESP 缓冲液于50轻度振摇温育48h 。6 将凝胶块放在10mL 含有174g/mL 苯甲基磺酰氟(PMSF的TE 缓冲液中，室温温育4h(2h 换液一次 ，以灭活ESP 中的蛋白酶K 。7 用TE 清洗琼脂块6h(2h 换液一次 ，置于TE 中4保存。2. 限制酶消化提高PFGE 的分辨率取决于1001000kb 片段电泳结果的重复率，它与酶切关系密切，可在琼脂糖凝胶块中使用合适的内切酶消化。（生物秀实验频道 ）125L10 反应缓冲液，30U 限制酶，加双蒸水至250L 混匀。2 取一个凝胶块置其中，合适温度下温育过夜(按内切酶要求 后，用TE 缓冲液洗涤并贮存。3. 应用PFGE 对样品DNA 进行分析1 用0.5TBE 缓冲液制备一个0.8%SeakemHGT 琼脂糖凝胶，胶的厚度尽量与样品凝胶块相符。若用Wide Minisub Cell进行电泳的话，50mL 该溶液即可。2 胶凝后，小心移去样品梳。将凝胶块用小刀切成与加样孔一致的大小，将样心地插入加样孔，避免产生气泡。(若样品在溶液中，以l:1的比率与 502%Seaplaque 琼脂糖相混合，迅速注入加样孔中 。3 把胶放入电泳槽内，加缓冲液，刚好覆盖胶的表面即可，缓冲液事先14冷却。4 将电泳槽和一个连着稳压电源的程序性开关设备相连。打开电源，调节蠕动泵到适当流速(510mL/rain或打开变速泵至40。5 通过计算机启动极性转换程序。大于50kb 的限制性片段在1.2s 和0.4s 正向和反向的电脉冲下得以分离，时间一般为3.5h 或更长。小于50kb的限制性片段在0.4s 正向和0.2s 反向的电脉冲(比率为2:1下得以分离，时间为35h 。6 在 0.5g/mL 溴化乙锭中进行染色并拍照。4. 分离、纯化大的DNA 片段1 凝胶染色、分析后，在目的带前(靠近正极处 切一个 0.25cm2左右的槽，注入0.8%Seaplaque琼脂糖，使之凝固。2 重新打开极性转换开关，用紫外递质检测DNA 的迁移，当目的带进入Seaplaque 凝胶中时，关闭开关，切下目的带，移至1.5mL EP 管中。3 加入2L 的tRNA ，30L 5mol/L NaCl，370L 蒸馏水，在6570之间，化胶并保温10min 。4 苯酚/氯仿500L 抽提两次。5 用2.5 倍体积95%乙醇和1/10 体积NaAc(3mol/L，pH5.2 于-7010min 沉淀水相。再用70%乙醇洗两次并将沉淀溶于TE缓冲液中。【注意事项】1. 换缓冲掖时尽可能小心不要碰坏琼脂凝胶。2.PMSF 是一个强烈的蛋白酶共价抑制剂，即有毒又挥发，操作时应在通风橱中进行。3. 用蛋白酶K 包埋的材料时50温育时间很长(2448h ，有些学者提出如此长时间不必要(Mortimer etal.1990 ，且可能造成高分子质量DNA 降解。在实验中可视情况而定。4. 琼脂糖凝胶块在TE(pH7.6中4可存放数年，如在0.5mol/L EDTA 中可存放更长时间。5. 一些高压电源并不适合脉冲电场凝胶电泳，因为这些电源设计时均带有保护电路，它可以检测到负载的突然降低并且引发外加电源自动关闭。6. 由于电压较高，就会产生热量，为了保证温度为14，需要一些冷却设备(缓冲液冷却循环器或MiniChiller 。此外，把电泳系统放在一个敞口的冰盒中也可保持恒温。PFGE （脉冲场凝胶电泳）标准操作规程(SOP目的：运用PFGE 方法对20Kb 至数Mb 的DNA 进行分子分型背景知识：这个试验是公认的操作繁琐，至少要2天，而且每一步操作对结果的好坏都有很大影响，因此，一个严格、标准的操作方法是十分十分必要的。主体内容：一、胶块的制备1、在Falcon 2054管上标记样品名称和空白对照，分别加入约2ml 细胞悬浊液(CSB；2、在1.5ml eppendorf管上标记好对应样品的名称；3、在模具上标记好对应样品的名称；4、用CSB 湿润接种环，从培养皿上刮取适量细菌，均匀悬浊于CSB 中，用bioMerieux Vitek colorimeter 测其OD 值，并调整至3.64.5。如果OD 值大于4.5，加入CSB 稀释；如果OD 值小于3.6，增加菌量提高其浓度。5、取400l细菌悬浊液于相应的1.5ml eppendorf管中，置于37水浴中孵育5分钟。将剩余的细菌悬浊液置于冰上直到胶块制备好放在水浴摇床中。6、从水浴箱中取出eppendorf 管，每管加入20l蛋白酶K(储存液浓度为20mg/ml混匀，使其终浓度为0.5mg/ml。7、制备好1%Seakem Gold：1%SDS，放于56水浴箱中。8、在eppendorf 管中加入400l的1% Seakem Gold：1%SDS，用枪头轻轻混匀。9、将混合物加入模具，避免气泡产生，在室温下凝固10-15分钟。注意事项：(1用后的接种环要放在指定的废弃物容器中。(2细胞悬浊液、蛋白酶K 要置于冰上。(3在混合细胞悬浊液和1% Seakem Gold：1%SDS时要避免气泡的产生。(4混合物加入模具时不能产生气泡。(5在加1% Seakem Gold：1%SDS的过程中1% Seakem Gold：1%SDS要一直放在56水浴箱中。二、细胞的裂解1、在50ml 的screw-cap tube上做好标记。2、配制细胞裂解液(CLB：每5ml 细胞裂解液加入25l蛋白酶 K(20mg/ml，使其终浓度为0.1mg/ml，然后颠倒混匀。注意：蛋白酶K 要置于冰上，配制好的细胞CLB 也要置于冰上。3、每个管子加入5ml 蛋白酶K/CLB混合液。4、如果想使胶块平齐，可以用刀片削去模具表面多余的部分。(1可重复利用的模具：打开模具，用小铲的宽头部分将胶块移入相应的screw-cap 管中。(2一次性模具：撕掉模具下面的胶带，用小铲将胶块捅进相应的screw-cap 管中，将模具、胶带、小铲放入废弃物容器中。5、保证胶块在液面下而不在管壁上。6、将管子放在54水浴摇床中孵育2小时，转速约170转/分钟。7、将纯水和TE 放在50水浴摇床中预热。三、洗胶块1、从水浴摇床中拿出screw-cap 管，盖上绿色的screened-cap 。轻轻倒掉CLB 。在实验台上轻磕管底使胶块落在管底。注意：把管倒置在吸水纸上，使管内液体被尽量排除干净。随后的操作中也如此。2、每管中加入15ml 预热的纯水。3、确保胶块在液面下而不在管壁或盖子上，放回50水浴摇床中，摇10分钟。4、倒掉水，用纯水再洗一次。、5、倒掉水，加入15ml 预热的TE ，在50的水浴摇床中摇15分钟。6、倒掉TE ，用TE 重复洗三次，每次1015分钟。7、倒掉TE ，加入10ml TE，放在4冰箱保存备用。注意：要确保胶块在液面下而不在管壁或盖子上。四、胶块内DNA 的酶切1、在1.5ml eppendorf管上标记好相应的样品及H9812的名称。2、按照下面的比例配制缓冲液H 的稀释液，混匀。试剂l/胶块l /10胶块纯水180l1800lBuffer D20l200l总体积200l2000l注意：缓冲液要置于冰上。3、在每个1.5ml eppendorf管中加入200l缓冲液H 的稀释液。4、小心从TE 中取出胶块放在干净的培养皿上。5、用刀片切下2mm 宽的胶块放入1.5ml eppendorf管中。确保胶块在液面下面。将剩余的胶块放回原来的TE 中。6、用同样的方法处理标准株H9812的胶块。7、将管子放在37水浴中孵育10-15分钟。8、在用稀释缓冲液孵育的过程中，按照以下的比例配制酶切缓冲液，混匀。试剂l/胶块l /10胶块纯水175l1750lBuffer D20l200l酶(10U/l5l50l总体积200l2000l注意：(1将酶置于冰上，用后立即放在20保存。(2用枪头吸出缓冲液H ，避免损伤胶块。9、每管加入200l混合液，轻轻在实验台上磕管子的底部，确保胶块在液面的下面。10、在37水浴中孵育至少2小时。五、加样(一 将胶块直接粘在梳子齿上1、调整梳子的高度，使梳子齿与胶槽的底面相接触。用水平仪调整胶槽使其水平。2、从37水浴中取出胶块，平衡到室温。3、用枪头吸出酶切混合液，避免损伤或吸出胶块。4、每管加入200l 0.5TBE 。5、把梳子平放在胶槽上，把胶块加在梳子齿上。如果用的是10个齿的梳子，把标准菌株H9812加在第1、5、10个齿上。6、用吸水纸的边缘吸去胶块附近多余的液体，在室温下风干约3分钟。7、把梳子放入胶槽，确保所有的胶块在一条线上，并且胶块与胶槽的底面相接触。从胶槽的下部中央缓慢到入100ml 熔化的在5560平衡的1SKG 。避免气泡的生成；如果有，用枪头消除。在室温下凝固30分钟左右。8、记录加样顺序。(二 将胶块直接加在加样孔内1、调整梳子的高度，使梳子齿与胶槽的底面有一定间距。用水平仪调整胶槽使其水平。2、把梳子放入胶槽，从胶槽的中央缓慢倒入100ml 熔化的在5560平衡的1SKG 。避免气泡的生成；如果有，用枪头消除。在室温下凝固30分钟左右。3、小心拔出梳子。4、从37水浴中取出胶块，平衡到室温。5、用枪头吸出酶切混合液，避免损伤或吸出胶块。6、每块胶加入200l 0.5TBE 平衡。7、用小铲将胶块加入加样孔。8、用溶化的胶封闭加样孔。注意：a 可以在加样孔中加入0.5TBE ，利用毛细作用将胶块沉在加样孔底，尽量避免气泡形成。 b 记录加样顺序。六、电泳1、确保电泳槽是水平的。如果不水平，调整槽底部的旋钮。注意：不要触碰电极。2、加入2.2L 0.5TBE, 关上盖子。3、打开主机和泵的开关，确保泵设在70(这时缓冲液的流速约1L/分钟和缓冲液在管道中正常循环。4、打开冷凝机，确保预设温度在14(缓冲液达到该温度通常需要20分钟左右 。5、打开胶槽的旋钮，取出凝固好的胶，用吸水纸清除胶四周和底面多余的胶，小心的把胶放入电泳槽，关上盖子。6、设置电泳参数。7、记录电泳初始电流(通常120145ma 。8、结束电泳：关机顺序为：冷凝机泵主机。七、图像的获取1、取出胶，放在盛放400ml EB溶液的托盘内(EB储存液浓度为10mg/ml，1：10,000稀释，即在400ml 水中加入40l储存液 。注意：EB 是致畸剂。储存在棕色瓶中的EB 稀释液可以用3-5次。废弃的EB 溶液应妥善处理。2、将托盘放在摇床上摇25-30分钟。3、放掉电泳槽中的TBE ，用1-2L 纯水清洗电泳槽，并倒掉液体。4、戴上手套将用后的EB 溶液小心倒入做有标记的棕色瓶中，在托盘中加入400-500ml 纯水，放在摇床上脱色60-90分钟，如果可能每20-30分钟换一次纯水。5、用Gel Doc 2000拍摄图像。注意：如果背景干扰分析，可进一步脱色30-60分钟。6、转换成*.1sc文件用于处理分析。八、数据的分析图像的读取电泳图像通常用BIO-RAD 的GEL DOC 2000或其它成像系统来获取。其它可以替代的成像设备，只要具有CCD 相机，可以提供IBM 兼容的未压缩的TIFF 图像，且分辨力768 x 640像素，能够用BioNumerics software (Applied Maths, Inc.软件与PulseNet 数据库中其它图像进行对比分析，也可以运用。运用GEL DOC 2000的简单说明：QUANTITY ONE软件1、点击QUANTITY ONE按钮打开该软件。2、点击菜单FILE GEL DOC。注意：需要1020秒打开窗口。3、打开抽屉，把胶放在台板上。胶已经经过EB 或GEL-STAR 染色并经过充分脱色。用黑色胶框把胶放在合适的位置。关上抽屉门。图像的获取1、按下EPI-LIGHT 按钮打开白光。2、把胶放在调准网格线内，使胶的加样孔和调准网格线的最上面一条蓝线对齐。3、保证调准网格线和过饱和按钮被选中。4、改变镜头的MIDDLE RING以调整图像的大(顺时针 小(逆时针 ，使图像占据整个窗口。如果需要，挪动胶在台板上的位置。胶的加样孔、下边界和左右边界在屏幕上都应该可以看到。5、如果需要，按BOTTOM RING以调整相机的焦距。注意：焦距的调整只可以偶尔用之，不可用于每一块胶。可以用尺子帮助调整焦距。6、按下EPI-LIGHT 关掉白光，按下UV 按钮打开透射紫外光。7、点击AUTO EXPOSE以确定大概的曝光时间。当图像出现在窗口时，AUTO EXPOSE自动关闭而MANUAL EXPOSE被激活。8、点击MANUAL EXPOSE 的按钮，调整曝光时间。而调整饱和度时，点击箭头或TURN THE TOP RING以降低光量(如果图像过饱和，图像显现红色 。注意：如果出现对话框“曝光可以在0.03360秒之间波动”，则需通过改变相机的像素以调整饱和度。调整饱和度使样品条带没有红色很重要，因为这会影响BIONUMERICS 软件对胶图像的分析。而胶加样孔的过饱和属于正常现象。9、当图像调整的比较满意时，按下FREEZE 按钮停止曝光过程。按下UV 按钮关掉紫外光(如果开门时UV 灯打开，它会自动关闭 。图像的输出1、保存图像(*.1sc：FILE SAVE 。确保选择正确的路径。文件默认的名字包括日期、时间和用户。可以改变文件名。2、打印文件：FILE PRINT VIDEO PRINT，也可以直接点击屏幕上的PRINT 按钮。3、转为*.TIFF格式：FILE EXPORT TO TIFF IMAGEEXPORT ，选择正确的路径。4、关闭QUANTITY ONE程序：FILE EXIT 。5、取出胶放在染色盒内。用软麻布擦掉台板表面多余的液体，用水或70的异丙醇洗干净。 试剂储存液的配制1、121.1 g Tris base溶于650-700 ml纯水中，加入80 ml 6 N HCl*，在室温下调pH 至8.0，加水终体积至1000 ml，高压灭菌。或者157.6 g Tris-HCl 溶于800 ml 纯水中，在室温下调pH 至8.0，加水终体积至1000 ml ，高压灭菌。2、10 N NaOH*400 g NaOH小心溶于800 ml纯水中，冷却到室温，加灭菌的纯水使终体积至1000 ml。 3、0.5 M EDTA, pH 8.0*溶于800 ml纯水中，加入50ml 10N NaOH调pH 至8.0，加水终体积至1000 ml，分成数份，高压灭菌。4、20% Sodium Dodecyl Sulfate (SDS*十二烷基硫酸钠用于E. coli O157:H7, Salmonella and Shigella sonnei, PFGE将20克SDS 小心加入装有80 ml灭菌纯水的容器中，在35- 45轻轻混匀溶解，定容至100ml 。5、20 mg/ml 蛋白酶K 储存液*100 mg Proteinase K 粉末溶于5 ml 灭菌纯水中，混匀，分装在1.5 ml离心管中，每管500-600 l ，-20保存备用。6、10X Tris-0.9 M Tris base (108 g0.9 M Boric Acid (55 g0.02 M EDTA, pH 8.0 (40 ml 0.5 M溶于1000 ml灭菌的纯水中，高压灭菌注意：如果缓冲液有沉淀生成必须丢弃。7、Ethidium Bromide(EB*10 mg/ml EB的储存液用纯水1:10,000 稀释(即100 ml水中加入10 l 储存液 ，(500ml水中加50ul 。稀释液在丢弃前可以染5-6块胶。实验试剂注意：用灭菌的玻璃制品、塑料制品和纯水来制备以下试剂。1、Tris:EDTA Buffer (TE, pH 8.0*(10 mM Tris-HCL:1 mM EDTA , pH 8.010 ml 1 M Tris-HCL, pH 8.02 ml 0.5 M EDTA, pH 8.0用灭菌的纯水稀释到1000 ml在E. coli O157:H7, Salmonella and Shigella sonnei, and Campylobacter jejuni PFGE 用TE Buffer 于:. 溶解1% SeaKem Gold:1% SDS agarose. 细菌裂解后洗胶块在L. monocytogenes PFGE 用TE Buffer于:. 悬浮菌细胞. 细菌裂解后洗胶块2、Cell Suspension Buffer (CS100 mM Tris-HCl:100 mM EDTA, pH 8.0用于E. coli O157:H7, Salmonella, and Shigella sonnei PFGE10 ml 1 M Tris-HCl, pH 8.020 ml 0.5 M EDTA, pH 8.0用灭菌的纯水稀释到100 ml3、Cell Lysis Buffer(CLB50 mM Tris-HCl:50 mM EDTA, pH 8.0 + 1% N-Lauroyl-Sarcosine,Sodium salt (Sarcosyl，0.1mg/ml Proteinase K (用前再加入用于裂解E. coli O157:H7, Salmonella, Shigella sonnei,和 Campylobacter jejuni 25 ml 1 M Tris-HCl, pH 8.050 ml 0.5 M EDTA, pH 8.050 ml 10% Sarcosyl 3用灭菌的纯水稀释到500 ml，每5 ml CLB加入25l 蛋白酶K 储存液(20 mg/ml，使其终浓度为0.1 mg/ml.5、0.5X TBE Buffer200 ml 5X TBE用纯水稀释到2000 ml或100 ml 10X TBE用纯水稀释到2000 ml注意：用来稀释5X TBE、10X TBE的纯水可以不灭菌。6、SeaKem Gold Agarose做胶块； 电泳胶报价 seakem gold 琼脂糖 25g 货号50111，1567元人民币。可打9折。125g 货号 50150 ，BMA ， 6422元。7、无菌的超纯水8、蛋白酶K 粉末或蛋白酶K 溶液(20mg/ml6、限制性内切酶E. coli O157:H7, Salmonella, Shigella sonneiXbaI, ，AvrII (同切限制内切酶BlnI ，SpeI(NotI可用于S. sonnei；但不用于E. coli O157:H7L. monocytogenes，AscI, ApaICampylobacter jejuni, C. coli，SmaI, KpnI器 材1、Dade Microscan Turbidity MeterSpectrophotometerbioMrieux Vitek Colorimeter调整细胞悬浊液的浓度2、微波炉溶胶3、水浴摇床裂解胶块中的细胞(54用水和TE(50 洗胶块4、56水浴箱平衡和保温熔化的胶5、25, 30, 37水浴箱酶切6、50水浴箱加热用于洗胶块的水和TE ，酶切7、离心机。8、最少需要两个水浴箱一个平衡到56，另一个到37。如果需要，温度可以上下调动。Listeria PFGE中胶块的ApaI 酶切需30水浴。耗 材1、无菌的Falcon 2054(12-mm x 75-mm或Falcon 2057(17-mm x 100-mm用于细胞悬浊液的制备基因公司代理 ，2、无菌的聚酯纤维或棉签用于从琼脂平板上刮取细菌3、无菌的枪头或巴斯得吸管4、无菌的1.5 ml离心管用于混合细胞悬浊液和胶、酶切5、无菌的50 ml screw-cap tubes 或50 ml Oak Ridge tubes 用于装胶块，6、Green Screened Caps(Bio-Rad 1703711洗胶块时用伯乐公司 货号 170-3711。7、模具10孔(可重复利用的，2cm x 1cm x 1.5mm50孔(一次性的，1.5mm x 10mm x 5mm8、单刃剃须刀、手术刀、平皿或类似物用于切胶块9、无菌的一次性皮氏平皿或大的玻璃载物片用于切胶块10、一端宽、一端窄的平铲药铲，生工等公司的实验室耗材部分有。11、标准胶槽(14 x 13cm的框和平板12、10孔的梳子(14 cm长，1.5 mm宽13、15孔的梳子(21 cm长，1.5 mm宽 Bio-Rad 170-362714、胶水平台15、盛放EB 染液的塑料容器16、70异丙醇、5%10%的漂白剂或其它合适的消毒剂17、各种体积的无菌烧瓶或瓶子(50 ml - 2000 ml18、各种规格的无菌量筒(100 ml - 2000 ml19、无菌的吸管(2 ml - 50 ml20、保护性手套(无石化粉的乳胶手套、聚乙烯手套或腈类手套21、防热性手套22、冰盒脉冲场凝胶电泳（PFGE ，Pulsed Field Gel Electrophoresis ）是一种分离大分子DNA 的方法。在普通的凝胶电泳中，大的DNA 分子（10kb）移动速度接近，很难分离形成足以区分的条带。在脉冲场凝胶电泳中，电场不断在两种方向（有一定夹角，而不是相反的两个方向）变动。DNA 分子带有负电荷，会朝正极移动。相对较小的分子在电场转换后可以较快转变移动方向，而较大的分子在凝胶中转向较为困难。因此小分子向前移动的速度比大分子快。脉冲场凝胶电泳可以用来分离大小从10kb 到10Mb 的DNA 分子。高分子量DNA 琼脂糖凝胶块制备和加工1收集10ml 全血，加入30ml 细胞裂解液。置冰浴中至少20min 直至红细胞完全溶解。22000r/min离心10min ，移去红色上清液，再次用细胞裂解液洗涤细胞，然后用PBS 重悬细胞。3稀释单细胞悬液并取一小份用Neubauer 腔计数细胞。4用PBS 重悬细胞，以达到40l PBS 中含1百万个细胞比例（1百万个二倍体哺乳动物大约含有基因组DNA 10g ）5用PBS 配制2浓度低熔点琼脂糖溶液并保持在50。6将等体积（各1ml ）细胞悬液与琼脂糖溶液于室温下混匀，立即倒入凝胶块模具中。7静置20min 让琼脂糖固化，用无菌塑料杯（通常用作划菌）将凝胶块自模具中取出并置入蛋白酶缓冲液中，加入2mg/ml的蛋白酶K 。8将带有凝胶块的蛋白酶K 缓冲液于50保持23天。每个盛有50ml 蛋白酶缓冲液的Falcon 管可容纳多达100个凝胶块。9蛋白酶K 消化后，可将凝胶块保留在此缓冲液或0.5mol/L EDTA溶液中保存于4。10 此外，继续将凝胶块用高压消毒过的TE 缓冲液冲洗数遍的步骤。11 将凝胶块放入装有TE 及0.04mg/ml PMSF 溶液的Falcon 试管中，灭活残留的蛋白酶K 。12 室温下用TE 溶液漂洗凝胶块数次，将凝胶块放入另一干净的试管，可直接用于酶切反应或用0.5mol/LEDTA ，（pH8.0）4保存凝胶块。13 若用EDTA 保存凝胶块，取出后应用TE 溶液室温下漂洗30 min2次。 大小标准物的制备 多联体1以TE 缓冲液悬浮4g/40l 。2用等体积TE 配制的2低熔点琼脂糖（温度保持在45）混匀。3移去混合液注入预冷的凝胶块模具中。4室温下用TE 及100 mmol/L NaCl溶液温育2天。酵母染色体1从YPD （酵母提取物，蛋白胨和葡萄糖）培养基瓶皿中挑选单一克隆加入10ml YPD 预培养的肉汤中，30下剧烈震荡生长24小时，然后加入200ml YPD肉汤，剧烈振荡2448h （产量大约100块）。24000g转速，离心10min ，然后用50mmol/L EDTA/10 mmol/L Tris-HCl(pH7.5溶液悬浮。3仍以4000g转速离心10min ，再用SCE1 mol/L 山梨醇，0.1mol/L枸椽酸钠，pH5.8及10 mmol/L 多联体（Boehringer MA宝灵曼公司产品），浓度为EDTA (pH7.5溶液重悬。4取稀释后的细胞悬液用Neubauer 腔计数。5溶液短暂离心后，再用SCE 重悬细胞，使40l SCE 溶液中含5107个细胞（相当于80l 体积的模块中含有5107个细胞）。6溶液与0.1mg/ml酵母扣糖酶100T 和100mmol/L-巯基乙醇混匀，37保温1530min 。7细胞悬液与等体积的SCE 配制的2低熔点琼脂糖凝胶混匀，保持在50。8将混合物移注入预冷的凝胶块模具中。9凝胶块用含10 mmol/L二硫苏糖醇的SCE 溶液37下振荡温育12小时。10 将凝胶块移入蛋白酶缓冲液中，加入2mg/ml蛋白酶K ，50温育48h 。11 用50 mmol/L EDTA/10 mmol/L Tris-HCl(pH7.5溶液洗涤凝胶块3次，每次20min 。12 凝胶块可用此混合液于4保存或不用漂洗直接装载入凝胶中。 琼脂糖凝胶块中DNA 的限制性内切酶消化1应使用消毒溶液及戴无菌手套以免DNA 降解。2在Falcon 试管中用1TE溶液漂洗凝胶块20min 3次，以去除EDTA 。3混合：酶反应缓冲液（高、中或低盐缓冲液），100mmol/L亚精胺（只用于高盐缓冲液状态），1020单位的内切酶。20单位的内切酶就足以过夜完全消化10g DNA。4设立一个除内切酶成分外含有混合物各组分的阴性对照，以检查是否有非特异性DNA 降解。5将琼脂糖凝胶块加入反应混合溶液中：通常用消毒过的手术刀或套环将凝胶块移入。6若两种内切酶所需缓冲液条件一致，可以同时或先后用两种不同的酶进行消化（先用低盐缓冲液的酶消化，再调整盐浓度）。倘若首次消化的酶要求50条件，在第二个酶消化时要换缓冲液。7若要进行部分消化，则首先在同一温度和反应时间用1：10稀释的酶进行尝试。 1将0.8的琼脂糖在0.25TBE中熔化后冷却至5060，立即注入凝胶框架中，并插入梳子。2凝胶固化后小心地拔出齿梳，用 2把无菌手术刀将DNA 凝胶块上样。若用不同内切酶消化凝胶块，则取不同样品时应将手术刀片烧灼后冷却。将DNA 大小标志物上样至凝胶的两旁。3用1液态低熔点琼脂糖凝胶（0.25TBE配制）密封狭槽。4若有气泡存在，用注射器驱赶气泡。5一旦密封的低熔点琼脂糖已固化（大约10min ），可将凝胶搁入腔室，并用电泳缓冲液覆盖过胶面。6应设定合适的电压及转换时间（参考分子医学技术84页表8.1）并开始电泳。两个不同电泳方向的电流应相等。7电泳结束后，凝胶用0.25TBE配制成的EB （0.4g/ml）染色。8用泵自槽中排除缓冲液，续以双蒸水冲洗电泳槽。9凝胶成像：DNA 在曝光的过程中可能会形成缺口。10 用0.25mol/L HCl漂洗凝胶30min ，让DNA 脱嘌呤，并有利于转移。11 凝胶用碱（变性溶液中）变性20min ，两次，续以中性溶液15min 。12 采用标准Southern 印迹方案将DNA 转印至尼龙膜上。一般来说，印迹PFGE 凝胶的时间较普通凝胶印迹时间长（约48h ）。脉冲场凝胶电泳（PFGES Agarose）PFGES Agarose有以下两种：一、InCert 琼脂糖-兆碱基片断DNA 制备获准使用的琼脂糖。LONZA 公司 InCert琼脂糖是一种极为有用的制备脉冲场凝胶电泳用染色体DNA 样品的低胶凝温度琼脂糖。研究 证实InCert 琼脂糖凝胶可支持凝胶中染色体DNA 的制备和限制性核酸内切酶消化。 应用：脉冲场凝胶电泳。分析说明：胶凝温度（1.5%）:2630硫酸盐：0.15% 凝胶强度(1.0%：400g/cm2熔化温度（1.5%）：70湿度：10%EEO(-Mr：0.10二、SeaKem Gold琼脂糖LONZA 公司 SeaKem Gold琼脂糖是一种高凝胶强度，低EEO ，标准胶凝温度的琼脂糖。这种遗传学术级别（Genetic Technology Grade，GTG ）琼脂糖最适于脉冲场凝胶电泳法（pulsed field gel electrophoresis ，PFGE ）快速分辨Mb （megabase ）50kb-10Mb ）DNA 和常规电泳方法分辨1-50kb 的DNA 与PCR 产物。因其低EEO 特性，SeaKem Gold琼脂糖中的DNA 电泳迁移速度要显著的高于常规琼脂糖凝胶。PFGE 的跑胶时间依使用的缓冲液和琼脂糖浓度的不同可减少至原电泳时间的50%。因其高凝胶强度，即使是使用低浓度（0.5%）的SeaKem Gold 琼脂糖凝胶，操作处理依然很方便，从而允许在常规电泳中分离更大的DNA 片断并减少PFGE 中的DNA 分离的耗时。应用：脉冲场凝胶电泳； 标准凝胶电泳分离大于23kb 的DNA 片断；Mb 大小DNA 印迹。分析说明：胶凝温度（1.5%）:34.537.5硫酸盐：0.10%凝胶强度(1