ELISA标准方法.doc

ELISA标准方法ELISA所用试剂1. 包被液：Na2CO3: 1.6g NaHCO3: 2.9g。加双蒸水至1升，调节pH值至9.6（室温保存）2. 5PBS（1L）： Na2HPO412H2O：68.8g NaH2PO42 H2O：8.97g NaCl：45g 加双蒸水至1L，室温保存34周。 3. 洗涤溶液：含0.05Tween20的PBS水溶液PBST（1L）： 5PBS：200mL ；双蒸水：800mL；10%的Tween20：5 mL4. 底物液： A：无水醋酸钠：8.2g 糊精：2.5g 过氧化氢脲：150 mg 加双蒸水至1000 mL，调pH至5.0，4保存。（使用时需达到室温）B：TMB 50mg 溶于二甲基亚砜（DMSO） 5 mL ，室温避光保存。使用前15分钟混合14.6 mL A液和0.45 mL B液。5. 封闭液：1%BSA（溶解于PBS中）6. 终止液：1.25M H2SO4实验方法1.半抗原与载体蛋白连接采用活性酯法连接。以连接KLH为例，具体步骤：精确称取半抗原活性酯10mg溶于1ml N,N-二甲基甲酰胺DMF中（溶液1）（20保存），载体蛋白10mg溶于2ml pH值为9.3的KH2PO4溶液中（溶液2），根据半抗原与载体蛋白摩尔比例为1：13，取适量溶液1缓慢加入到溶液2中，在冰浴中混合。然后放于4冰箱内过夜（18h），室温放置1小时后将反应液装入透析袋，4下、pH=7.4的0.01 mol/mL 的PBS中透析，然后精确量取蛋白质偶联物溶液的体积，测定浓度和结合比，加入叠氮钠（1/1000）4保存。2. 酶标抗原的制备制备半抗原的活性酯，采用方法同半抗原与载体蛋白连接方法(1)相同，只是收集透析后的液体中加入硫柳汞（1/10000），4保存。3.免疫程序免疫动物选择雄性新西兰大白兔（活雄性大耳白），月龄3个月，体重1.5公斤，饲养于标准实验动物房中，连续观察3天，确定身体状况正常后进行免疫。精确称取0.2ml人工抗原（5mg/ml）溶于0.3mL 0.9的NaCl溶液；与0.5mL弗氏完全佐剂乳化后初次免疫，采用多点皮内和肌肉注射。加强免疫用0.1ml人工抗原溶于0.4mL 0.9的NaCl溶液和0.5mL弗氏不完全佐剂乳化后免疫。分别于初次免疫后2周、4周、8周、12周、16周共加强免疫五次，分别于第三、四、五、六次免疫完后10天，由兔子的耳缘静脉取血，进行效价检测。4. 抗血清效价的测定：间接酶联免疫法包被抗原（与载体蛋白OA连接物）1ug/well，室温过夜；PBST洗板三次后加入1BSA/PBS 200uL/well室温封闭1h；PBST洗板三次后加入50uL/well梯度稀释的抗血清，室温孵育1h；PBST洗板四次后加入50uL/well酶标二抗，室温孵育30min；PBST洗板五次后加入TMB底物体系150uL/well，室温显色反应20min；加入1.25M浓硫酸50uL/well终止反应。酶标仪读数，选择吸光度值在0.71.2范围内的抗血清稀释倍数，即为抗体效价。5. 抗体的纯化：ProteinASepharose 4B亲和层析法用磷酸缓冲液平衡柱子，流速1mL/min；用磷酸缓冲液稀释抗血清后上柱，流速0.5mL/min。IgG（免疫球蛋白）被ProteinASepharose 4B吸附，其他杂蛋白随缓冲液流出；用磷酸缓冲液冲洗柱子，280nm检测，当基线平衡后用甘氨酸盐酸pH2.7缓冲液洗脱IgG，流速0.5mL/min。收集洗脱液，迅速用1M Tris-Cl pH 9.1中和抗体，用PBS透析三天。6. ELISA试剂工作浓度的优化6.1抗体包被浓度的确定根据实验经验，选用几种抗体浓度进行包被，固定酶标浓度，采用不同标样浓度进行直接竞争ELISA，绘制抑制率曲线 6.2酶标抗原浓度的确定以优化后的抗体包被浓度包板，固定游离抗原浓度，将酶标记物以不同稀释度稀释，进行ELISA分析，确定适宜的酶标记抗原浓度。选择吸光度值在0.7-1.2之间的酶标浓度为实验的酶标浓度。7直接竞争ELISA检测方法抗体以包被液稀释包被96孔酶标板，100Lwell，室温孵育整夜；PBST洗板3次；封闭液（200Lwell）封闭1h；PBST洗板3次；加入标样或样品和酶标抗原，各100Lwell，室温孵育1h；PBST洗板3次；加TMB底物液150Lwell；室温反应30min后，加50Lwell终止液终止反应；酶标仪波长450nm，650nm下读数。抑制率100A是吸光值X轴为西维因浓度，y轴为抑制率，以西维因浓度对数值及相应抑制率作图，标准曲线是典型的S型曲线。根据样品孔的抑制率查标准曲线求得实测样中西维因浓度，根据公式换算成实际样品中西维因含量。西维因浓度(ug/kg，ng/g) = CVM/WC根据样品孔的抑制率查得实测样中西维因浓度(ng/mL)V酶标板中加入样品稀释液的体积,mLM稀释倍数W样品质量，g8直接竞争ELISA检测方法性能指标的评价8.1检测限对于直接竞争ELISA法，检测限是指抑制率为15时的标准物浓度。8.2精密度8.2.1板内变异取六个不同浓度的标准溶液，进行ELISA分析，每个浓度作10个复孔，对于建立的方法进行精密度的测试，求得抑制率（IC）进行分析，例 西维因直接竞争ELISA板内变异浓度ICSDCV113.664.2130.80%223.263.7316.04%334.313.269.50%443.452.094.80%557.431.182.06%669.572.363.40%8.2.2板间变异取六个不同浓度的标准溶液，进行ELISA分析，每个浓度每天作两次分析，综合5天测得的抑制率（IC）进行分析，例西维因直接竞争ELISA板间变异浓度ICSDCV110.003.0330.33%225.847.3428.41%334.473.7210.78%444.874.9010.92%556.584.558.04%668.913.935.70%8.3准确度选择几种不含待测物的样品，分别添加4个不同含量水平的待测物，提取后采用建立的直接竞争ELISA方法检测，以加标回收率表示检测方法的准确度。9.基质影响样品基质对检测有一定影响。如果不做任何处理，样品直接提取测定，抑制曲线与标准曲线有很大差别，应对建立的方法进行样品基质的影响及消除研究。选择几种不同的样品，提取液用加有掩蔽剂的PBS适当稀释（常用含0.5鱼皮胶的PBS稀释若干倍，也可以根据相关文献采用其他掩蔽剂），建立基质的抑制曲线，与标准曲线比较，如果重合相关性较好说明基质影响消除。10.直接竞争ELISA检测结果与仪器分析结果的一致性以西维因为例。以建立的西维因高效液相色谱检测方法为标准，对建立的西维因直接竞争ELISA检测方法的准确性进行验证。首先是分别采用两种方法对同一样品进行分析，以结果的相关性表示两种方法的一致性；同时考虑到检测方法的实用性，又比较了不同处理方法下测定结果的一致性。10.1净化后样品的检测选用了5种不同样品，每种样品分别标准添加不同量的西维因，然后经确定的提取和净化方法处理得5套不同基质的含不同浓度西维因的样品溶液，对每一份样品同时进行两种方法检测，同一基质的两种方法检测结果进行线性回归，根据线性相关系数确定方法一致性。10.2 未净化样品的检测同样采用5种不同样品，每种样品分别进行标准添加不同量的西维因，用于液相分析的样品经SPE净化，而ELISA则采用提取后样品溶液直接检测，同样对两种方法检测结果进行线性回归求方法的一致性。11.试剂盒检测方法的优化11.1孵育时间，底物反应时间孵育时间会影响游离抗原和酶标抗原与包被抗体的结合，底物反应时间会影响显色程度，为缩短检测时间，提高试剂盒的检测效率，考查了60min，30min两种孵育及相对应的30min，15min两种反应时间。11.2抗体冻干保护剂抗体冻干时保护剂的添加对检测有很大影响，不加保护剂的抗体冻干后检测系统很不稳定，可能是冻干过程中抗体活性结合位点破坏，或者在4放置过程中，抗体被氧化，失去与抗原特异结合的活性，因此对抗体的保护是检测试剂盒成功的关键。实验中，通过稀释抗体的过程中加入保护剂，使抗体冻干后仍保持结合位点活性，同时在4贮存过程中，抗体仍保持活性，使检测性能不受影响。酶标记dip-stick 和Flow-throughdipstick插入式试纸条制备及分析步骤点样：用瑞士CAMAG半自动点样仪将抗体点于膜（1.5 cm10cm）上，点样完后将膜用小刀切割成一定大小(1.5cm1.0cm) （每条点样带长6mm）,抗体的量为1ug/每条带。固定：37恒温箱中固定30min封闭：将切割的试纸条浸泡在1BSA(in PBS)中，于37恒温箱中30min冲洗：用PBST(PBS中含0.05的Tween)冲洗（三次）封闭完的试纸条，用滤纸吸干多余的水分，将小试纸条粘贴于带有双面胶的透明塑料棒上。竞争反应：将准备好的试纸条插入含有西维因标样【100ppb,10ppb（均在5的甲醇中），0为5的甲醇溶液不含西维因】和酶标半抗原（酶标半抗原通过用活性酯采用碳化二亚胺EDCI法与HRP连接）（1：100000）按体积比6：1混合的溶液中竞争反应10min.冲洗：用PBST冲洗三次，甩干多余的水分显色：将竞争完的试纸条快速插入底物液（A+B）中，底物液A和底物液B在使用前15min混合。颜色越深，代表西维因的量越少。终止：用自来水冲洗，即可终止显色反应flow-through点渗式试纸条检测点样: 将滤纸用双蒸水润湿后，甩掉多余的水分，将滤纸紧贴于平滑的塑料板上，可用光滑的玻璃试管在滤纸上来回滚动，使滤纸与塑料板之间无气泡。将事先已经泡好的膜放在润湿的滤纸上，同样也要保证膜与滤纸之间紧贴，无气泡，否则将影响液体垂直通过膜的流速。每次加样都应这样准备。将抗体用微量加样枪（GILSON）加样于膜上用铅笔标记好的直径为8mm的圆圈中，每点体积20uL(实际抗体的量为1ug)。固定：先在室温下固定15min，再在37恒温箱中固定30min封闭：在1BSA(in PBS)浸泡，37恒温箱中30min洗涤：用PBST洗涤三次，轻轻甩掉多余的水分，37下放置30min干燥加样竞争：用微量加样枪将西维因标样【100ppb,10ppb（均配在5的甲醇溶液中），0为5的甲醇溶液不含西维因】和酶标半抗原稀释度(1:100000)按体积比6：1混合（或者先加标样，再加酶标抗原）加到点有抗体的位置（圆圈内），让液体垂直通过膜，标样与酶标抗原竞争与抗体的结合。洗涤：用PBST洗涤三次，轻轻甩掉多余的水分显色：将试纸条放在平皿上，将底物液（A+B）用枪快速均匀滴加到试纸条上。颜色越深，代表西维因的量越少。终止：将试纸条用双蒸水冲洗，终止反应。胶体金标记Flow-through 和lateral-flow胶体金颗粒的制备：1. 试剂：1HAuCl4 （氯金酸）水溶液1柠檬酸三钠水溶液2. 步骤取1mL1HAuCl4水溶液，加入99mL 纯水，得0.01HAuCl4溶液，于电炉上煮沸，保持沸腾状态2min，再加入2mL 1柠檬酸三钠水溶液，不停搅拌，待溶液变成深红色后，继续煮沸5min，冷却后调pH使用。（胶体金颗粒经电镜测得约为40nm左右，500600nm的紫外扫描得到一个最大吸收波长为525nm。胶体金的颜色为深红色）胶体金标记抗体的制备1.将制备好的胶体金调节pH9.0左右，将蛋白联到胶体金之前必须先做一个最适合蛋白量与胶体金的结合比例的优化实验。确定1mL的胶体金对应的最佳的抗体蛋白的量。2. 搅拌下，将抗体蛋白溶液逐滴加入一定量的pH9.0的胶体金溶液中。连接物在4静置过夜后，离心10000rpm, 4,30min。 弃去上清液，沉淀用含0.1BSA和0.1NaN3的2mM硼酸盐储存液（pH7.2）重混悬，一般说来，离心液离心后用储存液混悬至原体积的1/10。使用前将浓缩的胶体金抗体连接物稀释后再用。胶体金试纸的制备及检测步骤：抗原及抗体包被方式同酶标记试纸，.test line的 carbaryl hapten OVA的包被量为1ug/strip, control line 的 antirabbit IgG 包被量为 0.5 uL/strip（1：100稀释于 PBS buffer）。flowthrough形式：1. 将滤纸用双蒸水润湿后，甩掉多余的水分，将滤纸紧贴于平滑的塑料板上，可用光滑的玻璃试管在滤纸上轻轻来回滚动，使滤纸与塑料板之间无气泡。将已准备好（包被，封闭，干燥）的膜（Pierce）放在润湿的滤纸上，同样也要保证膜与滤纸之间紧贴，无气泡，否则将影响液体垂直通过膜的流速。若滤纸水分太多，影响液体垂直流过的速度，可在周围放上干滤纸，将多余的水分吸走。2. 将金标记的西维因抗体与西维因的标样（标样配置在5甲醇的PBS0.05 Tween buffer 中）按1：3比例混合，竞争反应5min后，再将50uL混合物滴加于test line和control line 的反应区域中，待液体完全流过时，可以直观与control（西维因的浓度为0）比