课题3--血红蛋白的提取和分离学案.doc

09-10学年高明区纪念中学 高三 级 生物 科学案 执笔：钟日文 审核： 备课组长签名： 课 题（理）课型课时讲学时间班级姓 名课题3 血红蛋白的提取和分离新课28月 日 【学习目标】1、尝试从血液中提取和分离血红蛋白2、了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理【重难点】教学重点：凝胶色谱法的原理和方法教学难点：样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填【复习】DNA的粗提取和鉴定完成下列实验步骤：【基础知识】阅读课本P5863，完成下列空格一、凝胶色谱法 1、概念：也称做 ；是根据 分离蛋白质的有效方法。 2、原理（1）由 构成的凝胶，内部有许多贯穿的的 。（2）当 不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量 的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程 ，移动速度 ，而相对分子质量 的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在 移动，路程 ，移动速度 ，从而使 不同的蛋白质分子得以分离。二、缓冲溶液 1、作用：在一定范围内，抵制 的 对溶液pH的影响，维持pH 。2、配制：由 种缓冲剂溶解于 中配制而成，通过调节缓冲剂的 就可以得到不同pH范围内使用的缓冲液。三、电泳 1、概念：指 在电厂的作用下发生 的过程。2、原理：在一定的 下， 、 等生物大分子的可解离基团会带上 或 ，在 的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷 的电极移动。 3、作用：电泳利用了待分离样品中各种分子 的差异及分子本身的 、 的不同，使带电分子产生不同的 ，从而实现样品中 的分离。 4、方法：常用的电泳方法有 和 。测定蛋白质分子量时通常使用 。 四、实验操作 1、样品处理：通过 、 、 等操作收集血红蛋白溶液。 (1)红细胞的洗涤：目的是 。分离时采取 ，直至上清液中没有 ，表明红细胞已洗涤干净。过程：血液柠檬酸钠低速短时离心吸出上层血浆红细胞5倍体积生理盐水 缓慢搅拌10min低速短时离心吸出上清液反复洗涤直至上清液无黄色 (2)血红蛋白的释放：在 和 的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。(3)分离血红蛋白溶液：把 离心后，将试管中的液体用 过滤、除去 ，于 中静置片刻后，分离出下层的 。 2、粗分离：即透析 (1)方法：将血红蛋白溶液装入 ，将 放入一定量适宜浓度的 中，透析 。 (2)目的：将 的杂质除去。 (3)原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子物质保留在袋内。 3、纯化：通过凝胶色谱柱将相对分子质量较大的杂质蛋白除去。操作如下：(1)凝胶色谱柱的制作。根据教材图519，说出制作色谱柱需要的材料。色谱柱的制作过程：准备材料加工橡皮塞安装色谱柱 (2)凝胶色谱柱的装填 材料：本实验使用的是 。 方法：凝胶用 充分溶胀后。配成 ，一次性 倒人色谱柱内。不能有 存在；不能发生 流干露出凝胶颗粒的现象。色谱柱的装填过程。步骤操作要求操作要求色谱柱垂直固定在支架上计算称量凝胶根据色谱柱体积计算凝胶用量配制悬浮液凝胶颗粒蒸馏水充分溶胀凝胶颗粒洗脱液沸水浴装填悬浮液一次性缓慢倒入；轻轻敲打缓冲液洗涤平衡立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h (3)样品的加入和洗脱 a、准备：加样前，打开流出口，使柱内凝胶面上的 缓慢下降到与 平齐，关闭出口。 b、加样：用 小心地将1mL透析后的样品加到 的顶端，注意不要破坏 。 c、加样后：打开下端出口，使样品渗入 内。洗脱：加入 ，打开下端出口，进行 。基本过程是：调节缓冲液面加入蛋白质样品调节缓冲液面洗脱收集分装蛋白质4、纯度鉴定：在鉴定的方法中，使用最多的是 。五、操作提示 1、红细胞的洗涤： 、 与 十分重要。 过少，无法除去血浆蛋白； 过高和 过长会使 等一同沉淀，达不到分离效果。2、色谱柱填料的处理：商品凝胶使用前需直接放在 中膨胀，可以将加入其中的 用 加热，加速膨胀。 3、凝胶色谱柱的装填：在装填凝胶柱时，不得有气泡存在。气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的 ，降低 。 4、蛋白质的分离：如果红色区带 地移动，说明色谱柱制作成功。【探究归纳】 一、人们用鸡的红细胞提取DNA，而用人成熟的红细胞提取血红蛋白的原因是什么? 二、洗涤红细胞时为什么不能用蒸馏水代替生理盐水? 三、在血红蛋白释放过程中。加入蒸馏水和甲苯的目的是什么? 四、凝胶色谱法的原理归纳【课堂总结】血红蛋白的取和分离凝胶色谱法原理分离过程凝胶电泳法缓冲溶液组成作用蛋白质的提取分离样品处理粗分离纯化纯度鉴定血红蛋白的提取和离蛋白质分子的差异性蛋白质分子的差异性凝胶色谱法原理分离过程凝胶电泳法凝胶色谱法原理分离过程凝胶电泳法缓冲溶液组成作用缓冲溶液组成作用蛋白质的提取分离样品处理粗分离纯化纯度鉴定蛋白质的提取分离样品处理粗分离纯化纯度鉴定【典例导析】类型一 凝胶色谱法分离蛋白质【例l】凝胶色谱技术是一种快速而又简单的分离技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果，目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛应用，不但应用于科学实验研究，而且，已经大规模地用于工业生产。据图回答问题：（1）a、b均为蛋白质分子，其中先从层析柱中洗脱出来的是 ，原因是 。（2）自己制作凝胶色谱柱时，在色谱柱底部d位置相当于多孔板的结构可由 替代。（3）装填凝胶色谱柱时，色谱柱内不能有气泡存在，原因是 。（4）洗脱用的液体应尽量与浸泡凝胶所用的液体 (填“相同”或“不同”)，洗脱时，对洗脱液的流速要求是 。类型二 探讨电泳的原理【例2】蛋白质分子中，氨基酸的-氨基和-羧基虽然大部分结合成为肽键，但是蛋白质分子内仍含有各种酸性基团和碱性基团，如肽链末端的-氨基和-羧基、天冬氨酸和谷氨酸残基中的羧基、赖氨酸和组氨酸残基中的各种碱性基团，所以蛋白质是两性电解质。在酸性溶液中，碱性基团的解离增大，使蛋白质带正电荷；在碱性溶液中酸性基团的解离加强，使蛋白质带负电荷。当溶液到达某一pH时，蛋白质可因内部酸性和碱性基团的解离相等而呈等电状态，这时的溶液pH叫做蛋白质的等电点。不处于等电点状态的蛋白质分子的正、负电荷量是不相同的。试回答下列问题：(1)多数蛋白质的等电点近于5，一般含碱性基团较多的蛋白质的等电点 (“偏高”还是“偏低”)。(2)根据等电点的不同，你能用 方法将不同种类的蛋白质分子分开。 (3)简述根据等电点分离不同种类的蛋白质分子的原理。【达标练习】一、选择题1凝胶色谱法是根据（ ）分离蛋白质的有效方法。A分子的大小 B相对分子质量的大小 C带电荷的多少 D溶解度2缓冲液的作用是：在一定范围内，抵制外界的影响来维持（ ）基本不变。A温度 B pH C渗透压 D氧气浓度3电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷（ ）的电极移动。A相同 B相反 C相对 D相向4.哺乳动物和人的成熟的红细胞中的（ ）与氧气的运输有关。A血红蛋白 B肌红蛋白 C肌动蛋白 D肌球蛋白5血液由血浆和各种血细胞组成，其中（ ）的含量最多。A白细胞 B血小板 C红细胞 D淋巴细胞6为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗凝血剂（ ）。A. NaCl B.甲苯 C.蒸馏水 D.柠檬酸钠7将搅拌好的混合液转移到离心管中，离心后，可以明显看到试管中的溶液分为4层，其中第3层是（ ）A无色透明的甲苯层 B脂溶性物质的沉淀层 C血红蛋白的水溶液 D其他杂质的暗红色沉淀物二、非选择题9、下面是凝胶色谱法分离血红蛋白时样品的加入(图I)和洗脱(图)示意图，请据图回答下列问题。(1)在加样示意图中，正确的加样顺序是 。(2)用吸管加样时，应注意正确操作，分别是 。贴着管壁加样、 。(3)等样品 。时，才加入缓冲液 。待 接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每 mL收集一管，连续收集。10、PCR技术可扩增DNA分子，电泳技术是将待测样品放在光滑的凝胶薄膜上，并加上直流电场，可利用分子带电荷不同分离和分析氨基酸和多核苷酸片段等有机物。这两项技术综合应用于现代刑侦，可以获得最可靠的证据。如图是一次寻找嫌犯的测试结果：图申是把遗迹中含有21个氨基酸的多肽进行水解，将氨基酸混合物进行电泳的结果；图乙是通过提取罪犯B遗迹DNA和四位嫌犯的DNA进行扩增，并采用特定限制酶处理后进行电泳所得到的一组DNA指纹图谱。 (1)在同一电场下，由于蛋白质或DNA的 以及 、 不同而产生不同的迁移方向或速度，从而实现样品的分离。 (2)在电泳过程中，带电分子会向着 的电极移动。 (3)由图甲得知，多肽由 种氨基酸组成；由图乙可知B最可能的对象是 。11、(能力拔高题)测定蛋白质的相对分子质量是研究蛋白质的一项重要技术，常用凝胶(由多孔性网状物质构成的颗粒，其孔能让小分子物质进出)过滤法测定，即在一根垂直的玻璃柱中装满凝胶，然后在其上端加入蛋白质混合液并用缓冲液进行洗脱。根据各种蛋白质洗脱的先后顺序可以比较它们的相对分子质量大小。利用下列材料,鉴定样品液(含有A、B两种相对分子质量大小不同的蛋白质)中蛋白质相对分子质量的大小。材料用具:支架台、符合要求的凝胶柱、吸管、缓冲液洗脱瓶、带有开关的玻璃导管、橡胶软管、夹子、试管若干、足量的缓冲液等。(1)实验步骤：加样前先 。加样： 。洗脱： 。收集并检测它们洗脱的先后顺序。 (2)实验结果及结论： 。(3)请用坐标图表示出不同蛋白质相对分子质量大小与洗脱液体积的关系：12、(2008山东高考)科学家发现家蝇体内存在一种抗菌活性蛋白。这种蛋白质具有极强的抗菌能力，受到研究者重视。(1)分离该抗菌蛋白可用电泳法，其原理是根据蛋白质分子的 、大小及形状不同，在电场中的 不同而实现分离。 (2)可用金黄色葡萄球菌来检验该蛋白的体外抗菌特性。抗菌实验所用培养基中的牛肉膏和蛋白胨主要为细菌生长提供 和 。 (3)分别在加入和未加入该抗菌蛋白的培养基中接种等量菌液。培养一定时间后，比较两种培养基中菌落的 ，确定该蛋白质的抗菌效果。(4)细菌培养常用的接种方法有 和 。实验结束后，对使用过的培养基应进行 处理。(1)凝胶色谱柱的制作。根据教材图519，说出制作色谱柱需要的材料。橡皮塞2个、打孔器、小刀、移液管、尼龙纱、尼龙网、玻璃管、尼龙管等。【典例导析】类型一 凝胶色谱法分离蛋白质【例l】【思路点拨】用凝胶色谱技术分离各种大分子物质时，大分子物质先洗脱出来，然后是小分子物质。大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布于颗粒之间，所以向下移动的速度较快。小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶颗粒内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质从而落后于大分子物质洗脱出来。在色谱柱中装填凝胶的时候要尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。一是在装填凝胶柱时，不得有气泡存在，因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。二是凝胶色谱操作过程中，不能发生洗脱液流干，露出凝