SDS-PAGE 电泳.docx

SDS-PAGE电泳过程中常见问题以及解决方法几乎所有蛋白质电泳分析都在聚丙烯酰胺凝胶上进行，而所有条件总要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并进可能减少其相互间的聚集，最常用的就是SDSPAGE电泳技术，关于大家在此过程中经常遇到的问题进行一些讨论：Q：SDSPAGE电泳的基本原理？A：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合 SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。Q：配胶缓冲液系统对电泳的影响？A：在SDSPAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是TrisHCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的 Tris甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。Q：样品如何处理？A：根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。1、还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT（或Beta巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离心加样。2、带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。100l样品缓冲液中10l 20%的碘乙酸胺，并在室温保温30min。3、非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1%SDS沸水中煮3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。Q：SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用？A:聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择trisHCL系统，具体作用后面介绍；TEMED与AP：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固；十二烷基硫酸钠（SDS）：阳离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。SDS-PAGE的影响因素1. 带电颗粒的性质净电荷多少、颗粒大小及形状。一般净电荷多，直径小而且近于球状，则泳动速度快，反之则慢。2. 电场强度（电位梯度）指单位长度（cm）支持物体上的电位降，它对泳动度起着十分重要的作用。一般电场强度越高，带电颗粒移动速度越快。根据电场强度可将电泳分为低压（常压）电泳100500V，电场强度为210V/cm，分离时间需要数小时、数天或更长。高压电泳5001000V，电场强度20200V /cm，电泳时间短。有时仅需几分钟，主要用于氨基酸、肽、核苷酸。由于电压增高电流增大需要冷却装置。3. 溶液的PH溶液的pH值决定带电颗粒的解离程度。也决定物质所带净电荷的多少。对氨基酸、蛋白质等两性电解质而言，溶液PH值离等电点越远，颗粒所带净电荷越多，电泳速度越快。反之越慢。血清中：白蛋白pI 4.0；2球蛋白 pI 5.06；球蛋白 pI 5.1；球蛋白 pI 7.1。在pH 8.6的缓冲液中电泳时，都带负电荷，其泳动速度为：白蛋白2球蛋白球蛋白球蛋白。为了利于分离蛋白质混合液，应选择一种使各种蛋白质所带电荷差异明显的pH值。4. 溶液的离子强度在保持足够缓冲能力的前提下，离子强度要求最小。溶液离子强度越高，带电颗粒泳动速度越慢，反之越快。通常选择在0.050.1mol/l 之间。缓冲溶液离子强度可通过下列公式计算：I=0.5cZ2；I 溶液的离子强度； c 离子浓度； Z 离子价数。如:0.154 mol/l 的NaCl溶液的离子强度。I=0.5（0.15412+0.15412）=0.154。5. 电渗作用在有支持物的电泳时影响电泳的另一个重要因素是电渗作用。电渗作用：在电场中，溶液对固体支持物的相对移动。电渗作用根据支持介质的不同而产生不同程度和不同方向的电渗流动。因此电渗作用与电泳速度关系密切。 SDS-PAGE注意事项1. SDS与蛋白质的结合按质量成比例（即：1.4gSDS/g蛋白质），蛋白质含量不可以超标，否则SDS结合量不足。2. 用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子量时，必须同时作标准曲线。不能利用这次的标准曲线作为下次用。并且SDS-PAGE测定分子量有10%误差，不可完全信任。3. 有些蛋白质由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（-胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在巯基乙醇和SDS的作用下解离成亚基或多条单肽链。因此，对于这一类蛋白质，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定的只是它们的亚基或是单条肽链的相对分子量。4. 有的蛋白质（如：电荷异常或结构异常的蛋白质；带有较大辅基的蛋白质）不能采用该法测相对分子量。5. 如果该电泳中出现拖尾、染色带的背景不清晰等现象，可能是SDS不纯引起。 考马斯亮蓝蛋白胶快速染色液常见问题问题原因对策背景高SDS及盐类等杂质未除尽电泳结束后，取胶放入双蒸水或去离子水中，延长洗涤时间或增加洗涤次数。染色过程中试剂变成蓝色SDS及盐类等杂质未除尽电泳结束后，取胶放入双蒸水或去离子水中，延长洗涤时间或增加洗涤次数。染色后未见蛋白条带凝胶过厚（超过1 mm）蛋白上样量太少建议使用厚度小于1mm的凝胶；如果胶非常厚，每次的洗涤时间需加长。建议在电泳时加两个不同量的BSA，并将此两个泳道作为阳性对照。SDS-PAGE 蛋白质电泳常见问题电泳中常出现的一些现象： 条带呈笑脸状，原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好。 条带呈皱眉状，可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。拖尾：样品溶解不好。纹理（纵向条纹）：样品中含有不溶性颗粒。条带偏斜：电极不平衡或者加样位置偏斜。条带两边扩散：加样量过多。聚丙烯酰胺凝胶电泳结果不正常现象和对策：1. 指示剂前沿呈现两边向上或向下的现象.向上的微笑现象说明凝胶的不均匀冷却,中间部分冷却不好,所以导致凝胶中分子有不同的迁移率所致.这种情况在用 较厚的凝胶以及垂直电泳中时常发生.向下的皱眉现象常常是由于垂直电泳时电泳槽的装置不合适引起的,特别是当凝胶和玻璃板组成的三明治底部有气泡 或靠近隔片的凝胶聚合不完全便会产生这种现象.2.拖尾现象是电泳中最常见的现象.这常常是由于样品溶解不佳引起的,克服的办法是在加样前离心,选用合适的样品缓冲液和凝胶缓冲液,加增溶辅助试剂.另一方法是降低凝胶浓度.3.纹理现象常常是由于样品中不溶颗粒引起的,克服办法是增加溶解度和离心除去不溶性颗粒.4. 蛋白带偏斜常常是由于滤纸条或电极放置不平行所引起的,或由于加样位置偏斜而引起.5. 蛋白带过宽,与邻近蛋白泳道的蛋白带相连,这是由于加样量太多或加样孔泄漏引起的.6. 蛋白带模糊不清和分辨不佳是由于多种原因引起的.虽然梯度凝胶可以提高分辨率,但与其他方法相比,常规聚丙烯酰胺凝胶电泳是分辨率较低的方法.为了提高分 辨率,不要加过多的样品,小体积样品