SOP SDS-PAGE银染标准操作规程.doc

标准操作规程文件号: QC-SOP-102 Page 4 of 4 Version: A/0 Print Date:题目： SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳-银染实验流程目的：为了使员工迅速掌握SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳-银染实验而编写的操作过程。范围：成员负责部门：QC Quality Assurance Department 姓名 签字 日期起草人：批准人：QA：生效日期：1. 概要1.1 本操作流程用来描述SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳-银染的标准操作步骤。2. 适用范围2.1 本流程适用于 操作人员进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳-银染实验的操作过程。2.2 本流程适用于在普通实验室中进行操作。3. 责权3.1质量保证部门有责任确保操作人员接受过该流程相关实验技术及操作的培训。3.2质量保证部门有责任确保该流程操作完全按照以下规范进行。3.3质量保证部门有责任定期检查修订本流程。4. 材料准备4.1 试剂和溶液4.1.1 SDS丙烯酰胺凝胶电泳所需的溶液见SOP-QC-100 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳实验流程 4.1.2 固定液 30ml甲醇，12ml乙酸，50ml水，50 l甲醛（100ml） 4.1.3 漂洗液 35%乙醇的水溶液 4.1.4 致敏液 0.02%硫代硫酸钠的水溶液 4.1.5 银染液 0.2%硝酸银的水溶液 4.1.6 显色液 6g碳酸钠，50l甲醛，2ml致敏液，加水定容到100ml 4.1.7 终止液 38ml甲醇，12ml乙酸，加水定容到100ml 4.1.8 保存液 1%乙酸的水溶液 4.1.9 分子量标准 蛋白标准分子量参照物使用Fermentas公司的PageRuler（10KD170KD） 4.1.10 蛋白样品 待分离的蛋白样品可为纯化的蛋白，也可为细胞裂解液。4.2 设备：4.2.1 蛋白电泳仪 公司 BIO-RAD 电源型号 PowerPac Universal4.2.2 单道可调式移液器 公司 Eppendorf4.2.3电子天平 公司 Acculab4.3 耗材： 吸头（T-20，T-200，T-1000，T-5000） 烧杯( 50mL，三个)Eppendof离心管玻璃表面皿（2个）5. 相关文件5.1 SOP-PUB-EQU-009 PH计（PB-10型）的操作使用以及清洁保养5.2 SOP-PUB-EQU-010 Acculab电子天平 操作、清洁与校准5.3 SOP-PUB-EQU-013 单道可调式移液器（Thermo/Gilson）的操作、清洁与校准5.4 SOP-QC-100 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳实验流程6. 操作步骤6.1. 参照SOP-QC-100 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳实验流程，通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质。6.2 银染 6.2.1 将凝胶浸泡在至少5倍体积的固定液中，室温，在摇床上平缓摇动2h。 6.2.2 弃去固定液，加至少5倍体积的漂洗液，室温，在摇床上平缓摇动20min，此步骤重复三次。 6.2.3 弃去漂洗液，加至少5倍体积的致敏液，室温，在摇床上平缓摇动3min。 6.2.4 弃去致敏液，加至少5倍体积的水，室温，在摇床上平缓摇动3min，此步骤重复3次。 6.2.5 弃去水，加至少5倍体积的银染液，避光，室温，在摇床上平缓摇动20min。 6.2.6 弃去银染液，如步骤6.2.4，水洗2次，每次1分钟。 6.2.7 弃去水，加至少5倍体积的显色液，用手轻柔摇动，仔细观察凝胶的变化，在数分钟内会出现蛋白质染色条带，继续摇动直至达到所需的对比度。6.2.9 加入终止液，摇动，使显色终止 6.2.9 把凝胶放在保存液中保存。 6.2.10用凝胶成像系统扫描凝胶，保存电子版文件。6.2.11按照 SOP-QC-113 干胶制作方法 制作干胶保存。6.3实验整理6.3.1试剂归于原位，清场。7. 注意事项7.1 丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。称量丙烯酰胺和N,N-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能含有少量未聚合材料。7.2 SDS 许多厂商售有特级SDS，其纯度足以满足电泳要求。尽管任何一种产品都能获得可重复的结果，但不能互相替代。若用一个厂家的SDS代替另一种SDS，多肽迁移的图谱变化甚大，故建议专门使用同一个品牌的SDS。7.3 过硫酸铵 过硫酸铵提供引发丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合的自由基，可用去离子水配制少量10%（m / v）储液于4保存。过硫酸铵会缓慢分解，故应每周新鲜配制。7.4 电泳时