转基因植物的筛选与检测PPT课件.ppt

转基因植物的筛选与检测 1 转基因植物的筛选与检测 问题1 进行转基因操作了 如何选出来已成功导入基因的细胞 2 转化体里的外源基因是否成功的表达了呢 1 2 一 筛选的方法与原理 通过特定基因在转化体内的表达 利用特定的试剂 选择出来转化细胞 注 1 特定基因又称 抗性基因 2 表达方式 蛋白质的合成 酶的失活等表 植物遗传转化中的选择试剂及其抗性基因 2 3 3 4 二 检测的方法与原理 利用特定基因在转化体内的表达 对其表达产物进行检测 不同分子水平上检测方法 SouthernPCR NorthernqRT PCR Western 4 5 报告基因 reportergene 是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因 也就是说 是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因 必须具有以下几个条件 1 已被克隆和全序列已测定 2 表达产物在受体细胞中原本不存在 3 其表达产物能进行定量测定 例如 Kan抗性基因 Gus基因 Bar基因 5 6 Gus基因存在于E coli等一些细菌基因组内 编码 葡萄糖苷酸酶 缺点 1 染色不均匀 2 不能进行亚细胞定位 3 不能进行活体染色 6 7 Southern印迹杂交是利用标记的探针 probe 与膜上靶DNA片段进行杂交的技术 检测靶DNA片段中是否存在与探针同源的序列 特点 可清除操作过程中的污染 如DNA分离及植物DNA分离过程中的交叉污染 以及转化愈伤胞间质粒残留所引起的假阳性信号 准确度高 Southern杂交程序复杂 成本高 且对实验技术条件要求较高 7 8 Northern杂交的主要原理是把变性RNA转移和固定在特定的薄膜上 用特定的DNA探针来检测RNA 特点 Northern杂交与Southern杂交相比 更接近于性状表现 更有现实意义 被广泛用于转基因植株的检测 但RNA提取条件严格 在材料内含量少 不适于大批量样品的检测 8 9 2020 3 20 10 Western印迹是将蛋白质从SDS PAGE胶中电泳转移至固相支持体上 然后对固定化蛋白质进行免疫学测定的方法 特点 Western杂交灵敏度极高 可以测出粗蛋白提取物中小于50ng抗原 在较纯的制剂中 可测出1 5ng抗原 能直接显示目的基因在转化体中是否经过转录 翻译最终合成蛋白而影响植株的性状表现 9 11 PCR qRT PCR是在体外快速特异地扩增目的基因DNA片段的有效方法 特点 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳 染色后很容易观察 不通过杂交分析就可以鉴定出基因组中的一些顺序 材料用量少 检测方便 可以在试管苗阶段 甚至对愈伤组织进行检测 了解转化早期的信息 便于及时优化试验方案 DNA提取方便 适合于大批量样品分析 又能检测目的基因的完整性 是早期检测的一种较好方法 10 12 Southern杂交 1 提取DNA2 电泳3 变性4 转膜5 固定DNA6 探针的标记7 杂交与检测 NBT BCIP显色 印迹 DNA 膜 转移 11 13 Southern杂交 转膜仪 把膜和胶片紧密结合 压 12 14 转膜 注意 此过程最重要的是保持各DNA片段的相对位置不变 故而称为印迹 blotting 用于转膜的固相支持物有多种 包括硝酸纤维素膜 NC膜 尼龙膜 Nylon 化学活化膜和滤纸等 双链DNA 变性 单链DNA 转移 固相支持物 电泳槽 缓冲液 夹板 13 15 Western 1 制胶及上样2 电泳3 转膜4 封闭5 抗体孵育6 曝光显影 曝光显影后的条带 14 16 总结 这些技术需要转膜 杂交 操作繁琐 费用高 可对转基因植株随机取样检测 Southern杂交特异性强 确定转基因植株中基因的存在 整