抗菌肽生产关键技术及其产业化改.doc

抗菌肽生产关键技术及其产业化吴松刚 施巧琴 郑 毅 黄建忠（福建师范大学工业微生物发酵技术国家工程研究中心 福州 350108）赵燕玉 蔡玉凤 孙 艳 黄钦耿 （福建省麦丹生物集团有限公司福州研究院 福州 350107）1.0 技术背景抗菌肽具有多种功效，可替代对人类健康有危害的抗生素和抗菌类药物在饲料中添加，是理想的无毒、无残留、高效广谱、抗菌，促生长的绿色饲料添加剂，被认为是抗生素的理想替代品。目前我国采用高效抗菌肽生产菌株，使用优化发酵工艺，配合低温干燥技术，生产具有高效价的抗菌肽产品。随着社会的发展和人们的生活水平提高，更多的人越来越关心食物的安全和健康问题，无污染、无残留和无公害的安全绿色食品已逐步成为人们一种新的消费追求。饲料添加剂是生产饲料的源头之一，其质量直接影响饲料的质量，而饲料的质量又直接影响到畜禽的质量，所以要生产出绿色安全的畜禽产品，就必须严把饲料添加剂的质量和安全关。目前，所有的常规抗生素都出现了相应的抗药性致病株系，致病菌的抗药性问题已经日益严重地威胁着人们的健康。随着抗生素的大量广泛用于饲料中和人们对食品和环境质量的要求越来越高，人们对抗生素的副作用认识日益加深，抗生素在饲料业中的应用，已面临着淘汰或禁用的局面。从2006年4月1日开始，欧盟已禁止在饲料中添加抗生素类饲料添加剂。许多国家对抗生素、化学合成药品的使用、淘汰、畜产品中的药物残留作了非常严格的限定，并致力于开发和推广无害的绿色饲料添加剂，以生产出安全可靠的食品“绿色畜产品”，来满足人们的需求。人们正从天然物质中寻找理想的无毒、无残留、高效广谱、抗菌促生长的绿色饲料添加剂，并应用于养殖生产。我国也已经开始限制抗生素在饲料中的添加和用量，应用无毒无公害的新型抗菌剂代替抗生素作饲料添加剂，已成为当前国内外饲料学科的一项重要内容。随着我国进入WTO，抗生素作饲料添加剂必将严重影响畜产品在国际市场的竞争力，借助生物高科技的最新成果，研发对环境友好型的、绿色环保的多肽类生物添加剂及抗生素替代剂，彻底扭转和杜绝滥用抗菌素和激素类添加物的问题，是提高人类健康水平、促进生产和生活质量需要迫切解决的课题。抗菌肽( Antibacterial peptide) 又叫抗微生物肽(Antimicrobial peptide) 、抗生素肽(Antibiotics peptide) 。抗菌肽是生物细胞特定基因编码产生的一类小分子多肽, 其生成和释放是机体炎症反应的组成部分, 是宿主防御病原微生物入侵的重要分子屏障。抗菌肽具有分子量低、水溶性好、热稳定、强碱性和广谱抗菌等特点, 愈来愈受到重视, 研究已深入到分子结构和作用机制等多个方面。抗菌肽最初是Boman 从天蚕的免疫血淋巴中纯化, 而后又在哺乳动物、鸟类、植物以及细菌中发现。时至今日, 发现的抗菌肽大约有800 多种。微生物来源的抗菌肽是抗菌肽家族中的重要一员, 它能特异性杀死竞争菌而对宿主本身无害,包括环形肽、糖肽和脂肽, 如短杆菌肽、杆菌肽、多黏菌素和乳酸链球菌肽等。如Lantibiotic 是革兰阳性菌产生的抗菌肽, 乳链菌肽nisin 是其中研究最为清楚的lantibiotic 类抗菌肽。一些由真菌产生的抗菌肽, 如哌珀霉素类( peptaibol) 抗菌肽, 主要由木霉属土壤真菌产生。随着人类对抗菌肽研究的进一步深入, 近年,不断从微生物中发现和提取具有抗菌活性的肽类物质。我国抗菌肽生产菌株普遍采用枯草芽孢杆菌，其产生的是一种混合多肽, 由于结构上很相似,各个成分极难分开。已报道的杆菌肽组分有A, A ,B, C, D, E, F, F1, F2, F3, G 等。A 组分是其中生物活性最高也是最重要的组分, 通常称之为杆菌肽Gramicidina, 分子式为C66H103N17O16S, 其结构是由12个氨基酸组成的多肽。具有环状结构, 分子中含有D-和L-氨基酸。对各种蛋白质水解酶如胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和无花果蛋白酶等具有很大的抗性, 也不受蛋白酶抑制剂的影响。与其它抗生素比较, 这是一个优点。如果把杆菌肽制成锌盐或亚甲基水杨酸盐, 就比天然产品要稳定得多。杆菌肽对多种革兰氏阳性病原菌, 如葡萄球菌、溶血性链球菌、微型球菌、藤黄八叠菌、非溶血性链球菌、魏氏梭菌、放线菌以及部分革兰氏阴性菌均有较强抑制作用。杆菌肽的作用机理是由于能抑制细胞壁所合成的脱磷化过程, 影响磷脂载体的转运及向细胞壁支架输送粘肽, 从而抑制细胞壁的合成; 另一方面是与敏感菌的细胞膜结合损伤细胞膜使细胞膜的通透性增加导致内粘质外流; 其次是干扰敏感菌细胞内原浆蛋白的合成。抗菌肽通过摧毁细菌的细胞膜起杀灭作用近年来, 杆菌肽制剂在动物饲料添加剂上的应用取得了巨大的成功, 杆菌肽锌( Bac-itracin Zine)被美国首先批准作饲料添加剂使用以来, 已为各国批准使用。因其抑菌促生性能良好,比较安全可靠, 成为发展最快、应用最广的新型饲料添加剂。我国已于1990 年批准生产与使用国内产品。2.0 抗菌肽生产关键技术2.1 高效价抗菌肽菌株的筛选在从昆虫及试样中分离出产抗菌肽的细菌菌株共156株,经鉴别其中:短杆菌48株、芽孢杆菌66株及乳酸链球菌42株,在初筛过程中，发酵效价在5000 /ml以上者有36株，其中：短杆菌8株、芽孢杆菌22株及乳酸链球菌6株,经复筛有15株发酵效价在5000/ml以上，均为枯草芽孢杆菌，以T-1045为最高达10453.3/ml，其次为T-1278，T-2856及T-3033均达9926.6 /ml。表1 高效价抗菌肽菌株的筛选结果之一菌号ODpH效价（/ml）菌落形态T-10080.215 5.54 6915.9较大0.216 5.49 0.214 5.53 T-10430.244 5.50 6916.90.226 5.49 0.223 5.52 T-10450.215 5.63 10453.30.213 5.62 0.213 5.62 T-12110.219 5.43 8952.80.227 5.53 0.207 5.54 T-12780.241 5.48 9926.60.216 5.55 0.226 5.51 T-12980.234 5.54 7668.2中等0.240 5.53 0.244 5.52 T-13440.235 5.52 5073.60.258 5.53 0.252 5.52 T-15760.264 5.54 7668.20.239 5.56 0.236 5.52 表2 高效价抗菌肽菌株的筛选结果之二T-15880.243 5.44 7556.4较小0.233 5.51 0.240 5.50 T-15920.245 5.51 7668.20.252 5.50 0.246 5.51 T-18790.238 5.49 7668.20.226 5.60 0.235 5.49 T-19660.257 5.52 7668.20.236 5.56 0.272 5.49 T-28560.247 5.55 9926.60.245 5.62 0.238 5.66 T-29360.266 5.49 8952.80.262 5.47 0.244 5.47 T-30330.242 5.44 9926.60.255 5.44 0.249 5.44 2.2 T-1045菌株种子及发酵培养基优化2.2.1 T-1045菌株种子培养基配方四因素七水平均匀法设计方案表3 种子培养基配方四因素七水平均匀法设计方案（%）因子蔗糖糖蜜玉米浆粉硫酸铵N12.004.202.200.50N22.603.802.000.65N31.804.000.900.70N41.404.801.500.60N52.203.001.300.55N62.404.401.100.45N71.603.401.700.402.2.2 T-1045菌株种子培养基配方四因素七水平均匀法实验结果表4 四因素七水平均匀法实验结果之一项 目N116h20h24hODpHODpHODpH0.3066.280.3197.340.2907.94N20.2886.220.3356.380.3067.91N30.3436.020.2885.810.3237.05N40.2546.050.2887.280.2927.60N50.2585.990.3286.910.3567.29N60.2766.120.2936.030.3517.08N70.2716.110.2727.620.2717.53表5 四因素七水平均匀法实验结果之二配方配方编号培养时间培养基成份蔗糖糖蜜玉米浆粉硫酸铵种子配方N-316h 1.804.000.900.70N-161.404.762.20.70N-220h 2.603.802.000.65N-202.604.802.20.70N-520h和24h 2.203.001.300.55N-2424h2.584.000.90.51发酵配方（一）25h3.505.30 0.84 0.60 注：N16、N20、N24分别为16h、20h、24h理论拟合结果表6 四因素七水平均匀法实验结果之三种子培养时间配方编号OD*50pHOD*100pH效价(/ml)16h种龄N-30.2865.810.194 6.01 83330.204 5.94 0.198 5.87 N-160.3067.160.186 6.13 85760.186 6.14 0.191 6.11 20h种龄N-20.3247.560.212 5.93 84760.182 5.90 0.212 5.94 N-50.2957.150.210 6.32 93040.204 6.37 0.207 6.44 N-200.3626.560.176 5.96 116670.201 5.89 0.202 5.92 24h种龄N-50.326.720.185 6.33 91060.175 6.41 0.171 6.32 N-240.3496.190.204 5.97 93670.208 5.94 0.2215.93 上述结果表明:种子N-20配方，发酵20h，效价最高达11667/ml。2.2.3 T-1045菌株种子及发酵培养基综合优化结果2.2.3.1 T-1045菌株种子培养基综合优化结果表7 T-1045菌株种子培养基综合优化结果配方PHOD生物量效价(/ml)1016.990.28338.0%173001025.450.11514.0%147301036.820.21717.4%150061047.780.24820.6%10767原配方6.420.12710.0%118682.2.3.2 T-1045菌株发酵培养基综合优化结果表8 T-1045菌株发酵培养基优化结果配方编号PHOD生物量效价(/ml)2016.70 0.24316%242802025.47 0.20811%256702036.40 0.29616%23450原配方7.15 0.31414%119662.2.3.3 T-1045菌株发酵培养基综合优化结果表9 T-1045菌株发酵培养基综合优化结果配方编号PHOD生物量效价(/ml)平均效价(/ml)3017.35 0.43722%27670276237.40 0.44222%275763026.38 0.16511%24806248096.34 0.17411%248113037.31 0.39223%21495214317.28 0.39427%213673047.11 0.42926%973097037.11 0.38926%9675原配方6.02 0.20712%11795117896.06 0.20312%118056.11 0.20212%11766上述结果表明:种子培养基以编号101最高,达17300/ml,发酵培养基以编号202最高,达25670 /ml,综合优化培养基以编号301最高,达27623 /ml，比原配方11789/ml，提高了134.3%，效果极为显著，实现了预定的技术指标。2.2.4 T-1045菌株发酵配方优化及产品载体比较表10 T-1045菌株发酵配方优化及产品载体比较之一配方编号种子培养时间种子培养结果发酵培养时间发酵培养结果OD值PH值OD值PH值效价（(/ml)40124h0.1876.3848h0.2907.492096040224h0.1976.7530h0.1946.731835740320h0.1246.4425h0.2155.1321505 表11 T-1045菌株发酵配方优化及产品载体比较之二配方编号载体湿样干样水分（%）效价（/g）水分（%）效价（/g）401膨化玉米44.58851313.7316625麸皮49.9662319.2518944402膨化玉米49.36630813.6014590麸皮52.4033359.9616625403膨化玉米41.83887111.9518944麸皮49.1165227.0319752上述结果表明:2.2.4.1 T-1045菌株发酵配方优化以编号403配方为最佳，发酵效价达21505/ml。2.2.4.2 抗菌肽产品载体比较了膨化玉米和麸皮，这两者均可作为载体，但麸皮效价稍高。2.3 抗菌肽产品稳定性试验 为了考核抗菌肽产品的稳定性，进行了24个月在室温条件下的效价变化，具体见表25和图1。表12 抗菌肽产品在室温条件下的效价变化 年-月月平均温度（）效价（/g）2010-1025.3225002010-1121.9220002010-1219.0210002011-0112.9200002011-0214.3195002011-0317.2193002011-0423.5190002011-0525.4188002011-0631.7185002011-0732.6181002011-0832.5176002011-0929.7175002011-1025.5170002011-1122.5165002011-1216.2161002012-0113.3157002012-0213.0150002012-0316.6143002012-0422.4140002012-0526.0120002012-0629.6110402012-0733.4105402012-0832.0101402012-0929.610040图1. 抗菌肽产品在室温条件下的效价变化上述结果表明:抗菌肽产品在室温条件下，经2年时间起始效价由22500/g下降到10040/g，下降率仅为55.4%。而1年的下降率仅22.2%，说明该产品具有相当好的稳定性，此项试验仍在继续进行中。3.0 抗菌肽应用效果3.1 抗菌肽对仔猪喂养试验及其效果3.1.1 试验分组：采用单因子浓度梯度法设计，试验设2组：对照组、0.3%生物抗菌肽组。每个组设4个重复，每个重复12头仔猪下表。试验分组序号项目对照组试验组1生物抗菌肽添加水平00.3%2仔猪头数（头）48483.1.2 试验材料：试验选用28日龄断奶、遗传背景相同、体重相近的仔猪随机分组。3.1.3 抗菌肽产品效价：8320/g3.1.4 试验日粮：按试验猪场正常使用日粮，生物抗菌肽按试验分组中的添加水平添加，直接加到配合饲料中制粒或拌料饲喂。3.1.5 试验时间：2012年1月5日起到2月4日结束，共30天。3.1.6 试验情况：按猪场正常饲养管理程序进行，试验期间自由采食、饮水，正试期间记录每天的饲料消耗量、腹泻情况，试验开始和试验结束禁饲(自由饮水) 24h 后空腹称重。经过30天的饲养试验，仔猪未出现疫情，没有出现死亡现象。仔猪腹泻方面，对照组偶尔有小猪腹泻，但情况不严重，康复较快，而试验组未腹泻现象极少。从皮毛质量方面看，试验组明显好于对照组。试验具体数据如表1：表13 抗菌肽对仔猪养殖试验效果序号项目对照组试验组1生物制剂添加水平00.3%2仔猪头数（头）48483初始总重（kg）4364384初始均重（kg/头）9.109.135总耗料量（kg）98611026日均采食量（kg/头.天）0.6850.7657试验末总重（kg）10451183