治疗性抗体的研究.doc

治疗性抗体的研究与应用的最新进展情况【摘要】作为一种具有靶向性的生物大分子，单克隆抗体始终是人们关注的热点之一，被广泛用于治疗肿瘤、病毒感染和抗移植排斥等。但鼠源单克隆抗体的临床应用受限于诱导产生人抗鼠抗体、肿瘤渗入量低、亲和力低和半衰期短等。随着分子生物学技术的发展及其向各学科的渗透，通过基因操作技术对抗体进行改造，可使其适用于多种疾病的治疗。抗体人源化已经成为治疗性抗体的发展趋势，同时各种抗体衍生物也不断涌现，它们从不同角度克服了抗体本身的应用局限，为治疗人类疾病提供了利器。本文简要介绍上述技术的基本原理、 特点和治疗性抗体的研究进展。【关键词】治疗性抗体；单克隆抗体；噬菌体；人源性抗体；抗体药物自1986 年第一个治疗性抗体进入临床以来，治疗性抗体得到了迅速的发展， 截止2012年， FDA共批准45个治疗性抗体，其已成为现代生物医药的重要组成部分。伴随现代科技的发展，治疗性抗体经历了鼠源性抗体，嵌合抗体， 改性抗体和表面重塑抗体(部分人源化抗体)， 以及全人源化抗体等不同发展阶段【1】。全人源化抗体因全部由人类基因编码的蛋白组成，其免疫原性小(副作用小)，临床药效好，是当前和未来抗体工程的主要发展方向。本文重点对全人源化抗体研究现状进行分析，并对未来治疗用抗体的发展趋势进行展望。目前正在研究中的生物技术药物有1 / 4以上是单克隆抗体药物,临床治疗中人抗鼠抗体反 应(HAMA)的出现使鼠源性单克隆抗体的应用受到极大限制。因此,对于疗程长、需反复给药的单克隆抗体药物,人源化是其重要而必然的发展方向。现阶段,已有30余个通过细胞工程和墓因工程制备的人源化抗体应用于临床,适应证包括变态反应性疾病、恶性肿瘤、器 官移植排斤反应、心血管疾病、病毒感染等难治性疾病。此外尚有近百个人源化抗体药物正处在临床前或临床研究阶段。预计它们将在人类疾病的治疗中发挥重要作用。自第一个基因工程抗体人鼠嵌合抗体于1984年诞生以来，新型基因工程抗体不断出现，包括人源化抗体、单价小分子抗体（Fab 、单链抗体、单域抗体等）、多价小分子抗体（双链抗体、三链抗体、微型抗体等）、某些特殊类型的抗体（双特异抗体、抗原化抗体、 细胞内抗体等）及抗体融合蛋白（免疫毒素、免疫黏连素等）等【2】。用于制备新型抗体的噬菌体抗体库技术成为继杂交瘤技术之后生命科学研究中又突破性进展。在噬菌体抗体库的基础上，近年来又发展了核糖体展示抗体库技术，利用核糖体展示技术筛选抗体的整个过程均在体外进行，不经过大肠杆菌转化步骤，因此可以构建高容量、高质量的抗体库，更易于筛选高亲和力抗体和利用体外进行的方法对抗体性状进行改造【3】。核糖体展示抗体库技术代表了抗体工程的未来发展趋势。1、 抗体治疗作用的机理抗体的基本单位是由4条肽链组成的对称结构，包括2条相同的重链和2条相同的轻链。重链和轻链分别由可变区和恒定区组成。可变区中的互补决定区( complementrity determing region，CDR)与抗体和抗原结合的多样性直接有关，而恒定区的结构与抗体的生物学活性相关。在少数情况下，抗体与抗原结合后可以对机体直接起保护作用，如用抗体中和毒素的毒性，但在多数情况下需要通过效应功能灭活或清除外来抗原。抗体的效应功能有2类，一类是通过激活补体，产生多种生物学效应，如细胞裂解、免疫黏附及调理作用，促进炎症反应；另一类是通过抗体分子中的Fc段与细胞表面Fc受体的相互作用，通过Fc段分别介导调理作用或抗体依赖性细胞毒作用。此外，治疗性抗体的效应和作用机理直接取决于它所识别的抗原决定簇，例如治疗非何杰金氏B细胞淋巴瘤的抗CD20抗体能影响细胞膜上离子通道的功能，从而调节B细胞的分化、增殖和凋亡。2、全人源化抗体研究进展全人源化抗体是指全部由人类抗体基因编码而成的抗体，克服了鼠源抗体和部分人源化抗体含有异种蛋白的问题，是当前研究和应用最为广泛的抗体类型。目前生产全人源化抗体主要有噬菌体展示重组人抗体文库技术和转基因动物技术两种方法，分析了不同方式生产的全人源化抗体及其与部分人源化抗体之间的差异【4】。2.1、噬菌体展示抗体(phage display generating antibody)1990年 McCAffery 等【5】首次证明抗体DNA片段可在噬菌体表面展示，随后利用噬菌体来进行基因工程抗体的研究取得了长足的进展。噬菌体展示抗体技术是将通过PCR扩增出淋巴细胞中整套编码人抗体的基因序列，克隆到噬菌体载体上，并以融合蛋白的形式表达到噬菌体表面，再通过表型筛选确定抗体的基因型，并利用噬菌体的DNA突变特性获得大量的突变体，再通过基因工程技术获得特异的全人源化抗体。利用这一技术目前已成功构建了多个不同类型的scFv、Fab和sdAb抗体文库，用于人源化抗体的研究开发【6】。该技术能够绕过免疫动物和细胞融合等过程，并能通过抗体片段的克隆选择，理论上能够分离得到几乎所有抗原的人源性抗体，但在实际研究过程中，抗体的亲合力和抗体库的容量问题是影响噬菌体展示技术应用的重要因素。在临床研究方面，利用噬菌体技术目前共开发了35种不同的治疗性抗体。10个已完成临床试验的抗体中有3个获得FDA批准(adalimumab，raxibacumab ，belimumab)，通过率30%， 另外还有3个处于I 期临床，19个处于II 期临床，3个处于III期临床。噬菌体技术生产的单克隆抗体在I期到II期以及II期到III期的临床分期间的转化率相对较高，但从III期临床到市场准入的比例约为50%，要低于用转基因动物技术生产的抗体【7】。3、抗体治疗的应用随着抗体制备技术的进步，治疗性抗体己逐渐从实验室走向临床，展示了光辉的前景。3.1、抗肿瘤作用由于多克隆抗体本身的局限性，所以直到单克隆抗体出现，抗体用于抗肿瘤治疗才真正得以实现。自从1978年成功制备出第一株抗黑色素瘤单抗以来，相继出现了抗胃肠癌、肺癌、乳腺癌、白血病、淋巴瘤、胰腺癌、神经胶质瘤等的单克隆抗体。单克隆抗体杀伤肿瘤细胞的机制可能是抗体依赖性细胞介导的细胞效应（ADCC）及补体依赖性细胞溶解作用（CDC）。单克隆抗体与药物、毒素或放射性物质偶联，成为一种全新的“生物导弹”，可用于导向治疗，已越来越受到重视。另外，用单抗给予T细胞所必需的重要表面信号分子交联的刺激信号和生长信号，体外诱导肿瘤特异性细胞毒T淋巴细胞（tumor specific cytolytic Tlymphocytes，TSCTL），可用于特异性、被动性的免疫治疗【8】。3.2、抗感染作用应用疫苗、免疫球蛋白可预防和治疗感染性疾病，但对不能获得相应疫苗的病毒感染、艾滋病及一些危重情况，如内毒素性休克等则无效。被动抗体疗法的主要机制是中和病毒，并已证明抗体在体外及体内中和病毒的效应不依赖于Fc介导的功能和双价抗体的存在， 但可能受抗体亲和力影响。抗体除了通过中和病毒发挥作用外，尚有其他机制。应用小鼠白血病病毒可诱发新生期小鼠急性致命的神经系统疾病。体外无中和病毒作用的抗Gag单抗在体内试验中表现出预防及治疗效应，显著延迟了疾病的发作，降低了中枢神经系统的病毒水平， 且与剂量相关，呈时间依赖性。这些结果提示非中和性抗体的效应与病毒感染的细胞表面表达Gag蛋白有关，但机制不清。3.3、抗器官移植排斥反应抗体主要通过阻断异体抗原的识别及排斥途径和分子机制中的某一环节而产生免疫抑制效应， 预防排斥反应发生。CD3分子及IL2R对T细胞的活化、增殖起重要作用，因此抗CD3分子及抗IL2R工程抗体的研究较为多见。3.4、构建独特型疫苗抗独特型抗体在结构和功能上均能模拟抗原（内影像作用）而发挥效应，据此构建的独持型疫苗模拟肿瘤相关蛋白抗原，能诱导抗肿瘤免疫反应。3.5、在自身免疫性疾病及变态反应性疾病中的应用自身免疫病多与单或寡克隆抗体的异常增多有关。利用基因工程技术可制备针对这些异常抗体独特型的抗抗体或与自身抗体结合并抑制其作用，或制备能模拟抗原的内影像抗体用于中和体内的自身抗体。目前针对不同的发病机制，治疗方法趋于多样化。许多变态反应与lgE有关。Fe片段可与变应原特异性 lgE竞争结合嗜碱性粒细胞，封闭变应原介导的组胺释放。此外，还可生产出与患者lgE竞争结合变应原的Fab样分子。4、治疗性抗体的临床研究现状4.1、治疗性抗体临床概况截止目前，共收录鼠源性抗体70个(小鼠来源的68个，大鼠来源的2个)，嵌合抗体37个， 人源化抗体172个，全人源化抗体149个。其内容涵盖了抗体的基本特性、靶抗原、临床信息、适应症等多个方面。通过对数据库资料的统计分析，发现肿瘤，免疫相关疾病(器官移植，自身免疫性疾病)及感染性疾病(慢性病毒感染、 炭疽等)是目前抗体治疗的主要适应症，此外针对骨质疏松，呼吸系统疾病，眼科疾病，肌营养不良，阿兹海默综合征及疼痛等的抗体治疗也是近年研究热点。截至2012年底，FDA 共批准了45个治疗性抗体，中国SFA 批准了17个治疗性抗体。此外，Therapeutic Human Polyclonals Inc ( THP)，Ablynx，OMT， Origen Therapeutics，revivicor公司等目前也在利用兔、骆驼、大鼠、鸡和猪开展人源化抗体转基因动物的研究【9】。4.2、目前治疗用抗体面临的主要问题治疗性抗体是近30年来生物医药发展最快的领域， 但目前在研发过程中仍然存在一些问题需要不断改进完善。一是目前治疗性抗体的工业化生产的产能有限，生产成本较高，限制了抗体的临床应用。涉及工业化生产的大规模细胞培养、抗体纯化和抗体生产质量控制技术有待进一步提高。二是确切可用的作用靶点有限，以及靶抗原的异质性，限制了新的治疗性抗体的开发，需要利用新的技术和方法寻找新的抗体作用靶点。三是抗体的药代动力学问题。为维持高的血药浓度，目前抗体药物的使用剂量一般为 5 20mg/kg 体重，但到达一些实体肿瘤中的抗体药物浓度仅为0001% 001%，因此延长抗体药物的半衰期，增加抗体在靶组织中的浓度，减少在非靶组织中蓄积等是需要重点解决的问题，其对改善抗体药物的安全性和有效性意义重大。此外，由于常规抗体分子量较大，不能通过血脑屏障，而一些小分子抗体片段在体内的半衰期较短，因此开发中枢神经系统等一些特殊作用部位的抗体面临重大的技术挑战，同时口服性等非注射类抗体也是目前抗体药物需要关注的内容【10】。5、结语及展望抗体应用于人类疾病的治疗已有很长的历史，但其发展历程是曲折的，自单克隆抗体;杂交瘤技术宣告诞生以来，历经多年反复。目前，FAD已经批准82个治疗性单抗上市【11】。近年来，科学界和医药产业界都对治疗性抗体的研究表现出越来越多的关注。人源化抗体和人抗体的出现为治疗性抗体的广泛应用带来了新的希望。但人抗体是否可以解决鼠抗体临床应用中出现的所有问题，还有待大量临床试验的检验。影响抗体免疫原性的因素很多，抗原呈递方式、次级信号系统以及患者的个体差异性等，而抗体的人源化只能解决一个方面的问题。同样，抗体衍生物也会面临诸如免疫原性、毒副作用等自身固有的问题，所以可行的发展方向是在完善人抗体技术的同时，推进治疗性小分子抗体衍生物的研究。根据临床实际设计灵活的治疗方案，使人源化抗体和抗体衍生物互为补充，达到最佳治疗效果。参考文献1Caldas C，Ceelho V，Kalil J，et a1Flumanimdon ofthe anti- CDl8 antibody 6 7: an unexpected effect of a framework residue inbinding to antigenMol Immunol， 2003，39:941- 9522JM.沃克，R.拉普勒，编;谭天伟，黄留云，苏国富，等译.分子生物学与生物技术M，北京：化学工业出版社，2003.13吴乃虎.基因工程原理（上册）M.北京：化学工业出版社，2003.14 Lonberg，NHuman antibodies from transgenic animalsNat Biotechnol，2005， 23: 1117- 11255McCafferty J，Griffiths A D，Winter G，et al Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody 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